miR-15b-5p在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达及意义

发布时间：2017-08-22 23:23

  本文关键词：miR-15b-5p在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达及意义

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【摘要】：目的:糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)常见的并发症之一,现已成为成人最主要的致盲因素,严重影响了患者的生活质量。目前,随着糖尿病发病率的逐年上升,DR的患病人数也在逐年增多。DR的发生机制复杂,目前尚不十分明确。关于DR的发病机制存在多种学说,如蛋白激酶C-甘油二酯、多元醇通路激活、晚期糖基化终末产物增多、氧化应激等均与DR的发病密切相关。已有研究证实,micro RNAs在DR的发生机制中发挥了重要的调控作用。micro RNAs是一类内源性非编码小RNA,主要通过抑制信使RNA(m RNA)的转录后翻译来调控蛋白表达。由于micro RNAs在DR发病过程中的机制尚不明确,本实验通过分析糖尿病大鼠视网膜组织中的micro RNAs进行表达谱分析,挑选出显著差异性表达micro RNAs进行生物信息学分析,筛选可能与DR发生有关的micro RNAs,用在线软件预测系统预测其靶分子,最终在基因水平上进一步揭示在DR发生的机制,为DR的预防和治疗提供全新的依据和思路。方法:1制备糖尿病大鼠模型:选取体重介于200-220g之间的雄性SD大鼠30只,将其随机分为两组,其中对照组10只,糖尿病组20只。腹腔单次注射柠檬酸缓冲液60 mg/kg作为对照组,腹腔单次注射1%STZ60mg/kg,作为实验组。72小时之后,检测SD大鼠尾部末端静脉血浆葡萄糖水平,若血糖值大于16.7mmol/L提示造模成功。2制备糖尿病大鼠视网膜病变模型:造模成功后,在糖尿病SD大鼠8周、12周、16周时摘取眼球。其中一只眼球摘取后迅速剥离视网膜组织冻于液氮中保存用于micro RNAs的检测,另一只眼球摘取后置于4%的多聚甲醛中固定,固定48小时后的眼球组织一部分制备成蜡块进行HE染色测量视网膜厚度并对神经节细胞(Ganglion cell,GCL)的数量进行统计学分析,固定好的另一部分的眼球组织在解剖显微镜下剥离视网膜组织,放于37℃3%的胰蛋白酶中消化2小时,待其消化至一层透明的血管网时,将其捞至洁净的防脱载玻片上并进行过碘酸-雪夫反应(糖原染色、PAS)染色,观察视网膜血管的大致形态及典型改变进行分析。3根据前期用HUVECs制备的氧化应激模型的micro RNAs基因表达谱改变情况,结合分析人与大鼠种属差异性的情况,筛选可能与我们的研究相关的micro RNAs。4用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测micro RNAs在SD大鼠视网膜组织中的表达,并通过全基因组及代谢途径数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes,KEGG)分析异常表达micro RNAs可能参与的信号通路。应用DAVID软件对异常表达的micro RNAs进行靶基因预测并对可能参与的信号通路进行生物功能富集分析(Enrichment for Gene Ontology,GO)。5统计学方法:所有数据采用(x±s)表示。用IBM SPSS 21.0软件进行数据处理,结果采用方差分析和独立样本t检验进行统计学分析,以P0.05为有统计学意义。结果:1对照组10只SD大鼠的静脉血糖水平均在正常范围;实验组20只SD大鼠中一只死亡,剩余19只均造模成功,即静脉血糖水平大于16.7mmol/L。2摘取对照组及实验组大鼠眼球后进行HE染色,测量视网膜层特定部位厚度后统计得出,实验组大鼠的视网膜厚度与正常对照组大鼠相比下降,GCL数量减少。PAS染色提示16周时实验组视网膜血管出现典型改变。其中造模成功后16周的实验组大鼠变化最明显,故在接下来的实验中提取造模成功后16周的实验组大鼠的视网膜组织进行micro RNAs检测。3 micro RNAs芯片结果:与正常对照组相比,实验组有5个显著差异表达的micro RNAs(P0.05),综合分析micro RNAs芯片结果,应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法检测实验组大鼠视网膜组织中miR-15b-5p,miR-17-5p,miR-195-5p,miR-497-5p,miR-106b-5p的表达,其中miR-15b-5p在大鼠视网膜组织中的相对表达量变化最为明显。4 miR-15b-5p的生物信息学分析结果显示:miR-15b-5p参与了钙离子信号通路、内吞作用、胰岛素信号通路、神经胶质瘤、2型糖尿病、粘附作用、前列腺癌等多个生物学过程。miR-15b-5p的靶基因主要参与了2型糖尿病、胰岛素信号通路及细胞凋亡等多种生物学过程的调控。结论:1糖尿病大鼠的视网膜组织中存在多种micro RNAs的改变,其中miR-15b-5p变化最为明显。2 miR-15b-5p表达的上调可能参与了DR的分子生物学过程。3生物信息学分析结果揭示miR-15b-5p参与多种信号通路,可能参与了DR的发生和发展并作为机制之一。
【关键词】：糖尿病视网膜病变 链脲佐菌素 糖尿病 MicroRNAs 生物信息学分析
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R774.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-19
• 结果19-20
• 附图20-23
• 附表23-28
• 讨论28-33
• 结论33-34
• 参考文献34-36
• 综述 microRNAs与糖尿病血管并发症之间的关系36-50
• 参考文献42-50
• 致谢50-51
• 个人简历51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 李玉媚;王辉;张文宇;陈伟;胡楠;欧和生;;内含子源性miRNA通过转录因子AP1调节内皮型一氧化氮合酶表达及血管内皮细胞增殖作用[J];中国动脉硬化杂志;2014年07期

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3 谢宁;吴颂;王晓博;关慧波;侯淑峰;;糖尿病动物模型研究进展[J];新乡医学院学报;2007年06期

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5 李维业;徐国彤;;凋亡是糖尿病视网膜微血管病变和神经元病变的细胞病理学基础[J];国际眼科纵览;2008年02期

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本文编号：721658