HDAC2表达在突发性聋患者激素抵抗形成中作用的观察

发布时间：2017-09-07 07:38

  本文关键词：HDAC2表达在突发性聋患者激素抵抗形成中作用的观察

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【摘要】：工作目的：突发性聋(sudden sensorineural hearing loss, SSNHL)指3天以内发生的原因不明的感音神经性听力损失,至少连续两个频率听力损失大于20dB,同时可伴有耳鸣和眩晕。糖皮质激素(glucocorticoid, GC)是目前治疗SSNHL的有效药物,然而并非所有患者在接受GC治疗后都有良好的转归,部分患者用GC治疗无效,听力提高不明显,提示对GC不敏感。本题意图通过对SSNHL患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)进行体外培养并进行PBMC体外增殖GC抑制试验(in vitro proliferation of GC inhibition test, IVPGCIT),比较不同SSNHL患者PBMC体外增殖抑制情况及其治疗后听力提高的水平,在治疗早期便预测患者对GC的敏感性。同时在治疗前后检测SSNHL患者PBMC中组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2, HDAC2)的水平,比较SSNHL患者HDAC2水平与GC抵抗的关系,以期在将来可对患者尽早进行个性化治疗,进一步提高治疗的有效率,改善患者的生活质量。研究方法：选择于我院接受治疗的突发性聋患者,治疗前及治疗结束后采集患者及的空腹外周血20 ml,同时采取健康志愿者空腹血20ml,作为对照,离心后在超净台内分离患者PBMC和自体血浆,然后进行两部分实验：1. PBMC体外增殖抑制实验：将PBMC悬浮于添加了10%患者自体血浆的RPMI1640培养基后分四组进行体外培养增殖抑制实验：A组为不添加药物的空白对照,B组加LPS (1 μg/ml),刺激PBMC的增殖,C组同时加入LPS和地塞米松(dexamethasone,DEX) (10-6M), D组为不添加细胞仅有培养基的空白组。将细胞置于37℃,5%CO2细胞培养箱培养24小时后,观察细胞生长情况并加入噻唑蓝(monotetrazolium, MTT)继续共培养4小时,之后,移除上清并加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解结晶,检测其在490nm波长处的吸光度(OD值)来反映细胞的增殖抑制情况。将所有患者的PBMC增殖抑制率及发病至就诊天数与治疗后受损频率平均听阈(pure tone average, PTA)改善值进行直线相关的比较,并按照受损频率PTA改善是否≥15dB将患者分为GC有效组以及GC无效组,比较两组患者PBMC曾殖抑制率、发病至就诊天数、性别、患耳侧别、发病时的听力曲线以及是否伴有眩晕对患者听力预后的影响。2. HDAC2活性及表达检测：提取PBMC的总RNA和细胞核蛋白,分别用real-time PCR法和HDAC2活性检测试剂盒,检测患者PBMC中HDAC2 mRNA的表达水平及HDAC2活性,按照受损频率PTA改善是否≥15dB将患者分为GC有效组以及GC无效组,比较两组HDAC2活性以及表达量与听力预后的关系,探讨HDAC2水平与GC抵抗之间的关系。结果：第二章：PBMC体外增殖抑制试验预测SSNHL患者GC敏感性的临床观察：培养24小时后,所有患者的PBMC均可被DEX抑制,但抑制程度有很大差异。将所有患者PBMC增殖抑制率与其各自受损频率PTA改善程度进行相关性分析,结果显示二者之间存在正的直线相关关系(R=0.688)。发病至就诊时间与听力改善呈负相关(R=-0.372),按照治疗后PTA改善程度进行分组,GC有效组共28名患者,PBMC平均增殖抑制率为：60.89%±25.29%,平均发病至就诊天数为：12.75±9.69天,治疗前后受损频率PTA分别为：82.46±13.84dB,53.92±20.92dB。GC无效组22位患者,PBMC平均增殖抑制率为：20.06%±16.42%(与GC有效组相比t=6.89,P=0.000),平均发病至就诊天数为：24.59±20.92天,治疗前后受损频率PTA分别为：90.27±12.59dB和86.52±13.12dB。多因素分析显示两组患者的性别、患耳侧别、听力曲线等均无显著差异,发病至就诊时间及PBMC增殖抑制率对患者听力预后有显著影响。第三章：难治性SSNHL患者PBMC内HDAC2表达与其预后的相关性分析：治疗前GC有效组及无效组患者的HDAC2活性显著低于对照组,而HDAC2 mRNA表达量显著高于对照组,治疗后,两组患者HDAC2 mRNA表达量较治疗前上调,GC有效组患者HDAC2活性上升并接近正常水平,而GC无效组患者HDAC2活性无明显变化。结论：SSNHL患者PBMC增殖抑制率和发病至就诊时间与听力改善程度之间密切相关,且PBMC增殖抑制率与听力预后间的关系更为密切。GC治疗有效的患者PBMC被DEX抑制程度显著高于GC治疗无效组,PBMC的IVPGCIT可以预测SSNHL患者对GC的敏感性,并可用来指导突发性聋的临床个性化治疗。SSNHL患者对GC不敏感可能与体内HDAC2活性降低有关,GC可以促使HDAC2mRNA的表达上调,局部注射GC联合全身应用银杏提取物,可以提高GC敏感患者的HDAC2活性和HDAC2mRNA表达水平,有利于患者听力提高。
【关键词】：突发性聋 糖皮质激素抵抗 外周血单个核细胞 组蛋白去乙酰化-2 PBMC体外增殖抑制实验
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.437
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 缩略词10-14
• 第一章 绪论14-19
• 参考文献15-19
• 第二章 PBMC体外增殖抑制试验预测SSNHL患者听力预后的临床关察19-32
• 引言19
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 仪器设备19
• 2.1.2 实验试剂及耗材19-20
• 2.2 研究对象20
• 2.3 实验步骤20-22
• 2.3.1 PBMC的分离20-21
• 2.3.2 PBMC体外培养及增殖抑制验21
• 2.3.3 统计学方21-22
• 2.4 实验结果22-26
• 2.4.1 临床资料22
• 2.4.2 各因素与听力预后的相关性分析22
• 2.4.3 两组患者的听力以PBMC增殖抑制率比较22
• 2.4.4 PBMC增殖抑制情况22-23
• 2.4.5 听力预后与PBMC增殖抑制率及发病至就诊天数均存在直线相关23-26
• 2.5 讨论26-28
• 2.6 结论28
• 参考文献28-32
• 第三章 难治性SSNHL患者PBMC内HDAC2表达与其预后的相关性分析32-44
• 引言32
• 3.1 实验方法32-33
• 3.1.1 仪器设备32
• 3.1.2 实验试剂及耗材32-33
• 3.2 研究对象33
• 3.3 实验步骤33-36
• 3.3.1 PBMC的分离33
• 3.3.2 提取细胞核蛋白33-34
• 3.3.3 组蛋白浓度测定34
• 3.3.4 HDAC2活性检测34-35
• 3.3.5 细胞总RNA的提取35
• 3.3.6 Real-time PCR检测HDAC2 mRNA表达35-36
• 3.3.7 统计学方法36
• 3.4 实验结果36-39
• 3.4.1 患者一般情况及听力随访结果36-37
• 3.4.2 HDAC2活性及HDAC2 mRNA表达37-39
• 3.5 讨论39-41
• 3.6 结论41
• 参考文献41-44
• 全文总结44-45
• 综述45-58
• 4.1 突发性聋的诊疗现况45-46
• 4.2 部分SSNHL患者存在对GC不敏感46
• 4.3 人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)体外增殖抑制试验可预估GC的敏感性46-47
• 4.4 GC在治疗内耳疾病中的作用机制47-48
• 4.5 HDAC2影响GC敏感性的分子机制48-49
• 4.6 氧化应激可能使HDAC2下调并从而导致GC抵抗49-50
• 4.7 盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)对GC作用的影响50-52
• 参考文献52-58
• 硕士期间发表文章、奖励及会议报告58-59
• 致谢59-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：808264