STGC3基因高表达对CNE2细胞自噬的影响及机制

发布时间：2017-09-12 19:35

  本文关键词：STGC3基因高表达对CNE2细胞自噬的影响及机制

  更多相关文章： 鼻咽癌 STGC3基因 自噬 mTOR CNE2

【摘要】：目的:研究STGC3基因高表达,对鼻咽癌CNE2细胞系自噬的影响,并探讨其可能的分子机制,为进一步阐明STGC3基因在鼻咽癌发病中的作用及分子机制提供新的实验依据。方法:运用慢病毒表达载体系统,建立STGC3基因稳定高表达的CNE2细胞系,通过荧光显微镜观察转染细胞红色荧光蛋白表达,qRT-PCR技术,检测STGC3 mRNA水平,实验确定转染效率;qRT-PCR及Western Blot方法,检测自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I、p62蛋白水平的变化;GFP-LC3瞬时转染CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬体的形成;Western Blot方法,检测p-S6、p-ULK1蛋白水平变化。结果:表达载体经DNA测序鉴定,结果表明STGC3高表达慢病毒载体RTP-h STGC3-his成功构建;将空载体(RTP-his)和RTP-h STGC3-his分别转染至CNE2细胞,荧光显微镜下可见RFP表达的红色荧光,证明RTP-his和RTP-h STGC3-his成功导入CNE2细胞;qRT-PCR方法,检测结果显示,RTP-h STGC3-his载体转染CNE2,CNE2细胞系恢复STGC3基因表达,成功建立STGC3基因稳定高表达的CNE2细胞(CNE2-RTP-h STGC3-his);CNE2-RTP-h STGC3-his和CNE2-RTP-his细胞,经无糖d-Hanks饥饿处理4h,分为实验组及阴性对照组,CNE2-RTP-his未经饥饿处理作为空白对照组,qRT-PCR和Western Blot检测结果显示,阴性对照组CNE2-RTP-his细胞中LC3mRNA表达上调,LC3-II/LC3-I比值升高,p62表达水平降低(P0.01);实验组CNE2-RTP-h STGC3-his细胞中LC3 mRNA表达下调,LC3-II/LC3-I比值降低,p62表达水平升高(P0.01)。瞬时转染LC3-GFP融合蛋白并予以饥饿处理,共聚焦显微镜可见阴性对照组CNE2-RTP-his细胞中绿色荧光斑点增多,而实验组CNE2-RTP-h STGC3-his细胞中绿色荧光斑点减少(P0.01),表明实验组细胞自噬体的形成被抑制;Western Blot检测结果显示:饥饿处理,阴性对照组CNE2-RTP-his细胞中p-S6和p-ULK1表达下调,而实验组CNE2-RTP-h STGC3-his细胞中p-S6和p-ULK1表达上调(P0.01)。结论:1.上调STGC3基因在CNE2细胞的表达,可抑制饥饿诱导的CNE2细胞自噬。2.STGC3基因在CNE2细胞高表达,可通过激活m TOR通路,抑制饥饿诱导的CNE2细胞自噬。
【关键词】：鼻咽癌 STGC3基因 自噬 mTOR CNE2
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要中英文缩略词表9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 技术路线14-16
• 1、构建 STGC3 高表达 CNE2 细胞系14-15
• 2、STGC3 高表达对 CNE2 细胞系自噬的影响及其分子机制15-16
• 第三章 材料与方法16-36
• 3.1 材料16-21
• 3.2 方法21-36
• 第四章 结果36-50
• 4.1 RTP-h STGC3-his 重组质粒的鉴定36-38
• 4.2 慢病毒载体稳定转染 CNE2 细胞后的 RFP 表达情况38-39
• 4.3 qRT-PCR 检测转染过表达载体后 CNE2 细胞中 STGC3 的表达39-42
• 4.4 STGC3 过表达对饥饿处理的 CNE2 细胞 LC3 表达的影响42-44
• 4.5 STGC3 过表达对饥饿处理的 CNE2 细胞 p62 表达的影响44-45
• 4.6 GFP-LC3 融合蛋白检测 STGC3 高表达对 CNE2 细胞自噬的影响45-47
• 4.7 Westernblot 检测 STGC3 高表达对 CNE2 细胞 p-S6 及p-ULK1 表达的影响47-50
• 第五章 讨论50-56
• 第六章 结论56-58
• 参考文献58-64
• 综述64-72
• 参考文献69-72
• 攻读学位期间发表的论文72-74
• 致谢74

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本文编号：839132