三七姜挥发油对人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡及周期阻滞作用的研究

发布时间：2017-09-15 19:51

  本文关键词：三七姜挥发油对人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡及周期阻滞作用的研究

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【摘要】：目的:研究三七姜挥发油诱导人鼻咽癌(CNE-2)细胞凋亡和细胞周期不同时相的分布,从周期调控的角度观察细胞周期相关基因的表达变化,并探讨其可能的抑癌机制。方法:1.采用水蒸汽蒸馏法对三七姜干燥根茎进行提取,按照常规方法分5次进行,收集上层精油,并计算其出油率;2.体外培养人鼻咽癌细胞株(CNE-2),分别用不同浓度(20、40、60、80、120、160、240μg·mL-1)的三七姜挥发油作用CNE-2细胞24、48、72、96 h后,采用MTT法检测三七姜挥发油对CNE-2细胞增殖抑制作用及IC50;3.倒置显微镜下观察CNE-2细胞生长情况;hoechst33258荧光染色观察不同浓度三七姜挥发油作用于细胞24 h后细胞凋亡形态学变化。4.流式细胞术(FCM)分析三七姜挥发油处理CNE-2细胞后对细胞凋亡和周期分布的影响;5.采用SYBR Green荧光染料实时荧光定量PCR方法筛查三七姜挥发油处理的CNE-2细胞中47个细胞周期调控相关基因表达谱的变化;6.用Western blot实验验证PCR实验筛选的部分与周期阻滞及凋亡蛋白的表达水平。结果:1.三七姜干燥根茎经水蒸汽蒸馏提取4 h后,分离上层精油,用无水乙醚溶解,加无水硫酸钠脱水,收集得橘黄色挥发油,其出油率为3.78%。2.三七姜挥发油能明显抑制cne-2细胞增殖及活性,并在一定的时间及浓度范围内(20、40、60、80、120、160、240μg·ml-1),抑制率呈明显的时间-剂量依赖性,其ic50分别为71.12,60.03,53.17,34.75μg·ml-1;3.倒置显微镜下观察,随着加药浓度的增大,细胞增殖缓慢,部分细胞变圆、皱缩;高倍镜下可见胞质内黑色碎颗粒物质增多,细胞膜弯曲可见坏死细胞及碎片;荧光显微镜可见凋亡细胞核的改变,呈致密浓染的强蓝色荧光,形成凋亡小体;当加药质量浓度达到100μg·ml-1时,镜下几乎很少能找到完整的细胞核,染色质逐步分裂为碎片;4.流式细胞术(fcm)显示经不同浓度的三七姜挥发油处理cne-2细胞24、48、72、96h后,annexinv/pi双染法提示三七姜挥发油能诱导cne-2细胞凋亡;pi单染法发现三七姜挥发油能使cne-2细胞停滞于g1期,呈剂量-时间依赖关系;5.实时荧光定量pcr法检测细胞周期调控相关基因表达谱发现,三七姜挥发油处理cne-2细胞24h后,与对照组比较,tp53、cdkn1a(p21)、cdkn1b(p27)、cdkn3、caspase-3、gadd45a等6个基因的mrna水平普遍升高,当加药质量浓度达到100μg·ml-1时,差异有统计学意义(p0.05);e2f1、atm、skp2、ccnd1、cdk6、cdc34、cdc25a、ccne1、cul1、abl1、cdc6、mcm3、mcm4、wee1、bcl-2、mdm2、ccna2、ccnb1、ccnb2、ccnd2、rad17、hus1等基因mrna表达水平呈不同程度的下降;6.westernblot结果显示,采用不同加药质量浓度三七姜挥发油(0、40、80、100、120μg·ml-1)处理cne-2细胞24h,对pcr筛选出的特异性表达的细胞周期调控相关基因进行检测,与对照组相比,加药处理组p53、p21、pparγ、caspase-3蛋白表达量增加,cyclind1与bcl-2表达下调;当加药质量浓度达到80μg·ml-1时,差异有统计学意义(p0.01)。结论:三七姜挥发油对人鼻咽癌CNE-2细胞有明显的生长抑制作用,呈剂量-时间依赖性,并通过诱导细胞周期阻滞及凋亡发挥抗鼻咽癌作用,其机制可能涉及p53依赖性途径及干扰DNA损伤修复的ATM-Chk2-Cdc25A通路等信号调控网络。因此,三七姜挥发油可能在治疗鼻咽癌方面有巨大潜力。
【关键词】：三七姜挥发油 鼻咽癌 细胞周期阻滞 凋亡 p53
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英汉缩略词对照表11-12
• 前言12-19
• 1 材料与方法19-42
• 1.1 实验材料与试剂19-21
• 1.2 主要实验仪器21-22
• 1.3 实验准备22-23
• 1.4 主要实验试剂的配制和准备23-26
• 1.5 实验方法26-42
• 2 结果42-57
• 2.1 三七姜挥发油对鼻咽癌CNE-2 细胞增殖抑制作用42-43
• 2.2 三七姜挥发油对CNE-2 细胞形态学观察43-45
• 2.3 流式细胞术分析三七姜挥发油对鼻咽癌CNE-2 细胞凋亡的影响45-47
• 2.4 流式细胞术分析三七姜挥发油对鼻咽癌CNE-2 细胞周期的影响47-49
• 2.5 实时荧光定量PCR检测细胞周期调控相关基因的表达49-55
• 2.6 Western Blot检测相关蛋白的表达55-57
• 3 讨论57-63
• 4 结论63-64
• 参考文献64-73
• 综述73-84
• 参考文献80-84
• 攻读学位期间发表的学术论文目录84-85
• 致谢85-87

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 孙晓杰;黄常志;;PI3K-Akt信号通路与肿瘤[J];世界华人消化杂志;2006年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 张东辉;杂色曲霉素诱导人胃黏膜上皮细胞(GES-1)G_2期阻滞及凋亡可能分子机制的研究[D];河北医科大学;2011年

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本文编号：858553