内质网应激对顺铂诱导离体小鼠耳蜗细胞凋亡的影响

发布时间：2017-09-24 01:41

  本文关键词：内质网应激对顺铂诱导离体小鼠耳蜗细胞凋亡的影响

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【摘要】：目的研究内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)对顺铂(cisplatin,CDDP)诱导离体小鼠耳蜗细胞凋亡的影响,探讨CDDP诱导耳蜗细胞凋亡的可能机制,为临床防护CDDP耳毒性聋提供新思路。方法将新生3~5天昆明小鼠耳蜗基底膜分离,置于含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的Dulbecco改良Eagle培养基/F12(Dulbecco's Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F/12,DMEM/F12)中培养,24h后弃去原培养基。1.将基底膜随机分成五组,对照组加入不含CDDP的新鲜培养基2m I,其余四组分别加入含有不同浓度CDDP(4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml和32μg/ml)的新鲜培养基2ml,继续培养24h后终止实验。应用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的鬼笔环肽荧光染色方法观察小鼠耳蜗毛细胞的形态学变化,耳蜗毛细胞计数检测毛细胞缺失率;应用异硫氰酸四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC)标记的鬼笔环肽与Hoechst33258双重荧光染色方法观察小鼠耳蜗毛细胞的凋亡,并检测毛细胞凋亡率;应用免疫印迹技术(Western blot)检测ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein,GRP78)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12,caspase-12)在小鼠耳蜗细胞中的表达;同时应用Western blot技术检测肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)在小鼠耳蜗细胞中的表达。2.将基底膜随机分成四组,对照组加入不含CDDP的新鲜培养基2ml,CDDP组加入含有16μg/ml顺铂的新鲜培养基2ml,牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)组加入含有500μg/ml TUDCA的新鲜培养基2ml,CDDP+TUDCA组预先加入含有500μg/ml TUDCA的新鲜培养基2ml,15min后加入16μg/ml顺铂,与其它三组同时培养24h后终止实验。采用Western blot技术检测GRP78和caspase-12在小鼠耳蜗细胞中的表达。结果1.FITC标记的鬼笔环肽染色显示为绿色荧光。对照组小鼠耳蜗内毛细胞(inner hair cell,IHC)和外毛细胞(outer hair cell,OHC)着色均匀,纤毛结构完好、排列有序,耳蜗毛细胞计数结果显示IHC与OHC的缺失率均低于1%;CDDP组小鼠耳蜗毛细胞出现纤毛倒伏、缺失、排列紊乱等形态变化,当CDDP浓度为4μg/ml时,OHC缺失率明显增大,与对照组比较差异显著(P0.05),而IHC缺失率无明显变化(P0.05);并且随着CDDP浓度的逐渐增高,耳蜗IHC与OHC的缺失率均显著增大,呈现明显的量效关系(P0.05,P0.01)。2.Hoechst 33258染色结果显示,对照组小鼠耳蜗毛细胞核呈淡蓝色,核内染色质分布比较均匀,毛细胞凋亡率低于5%。CDDP组小鼠耳蜗毛细胞核因明显固缩而呈亮蓝色,核内染色质边缘化、凝集成块状或呈不规则碎片状;并且随着CDDP浓度的逐渐增高,破碎的细胞核显著增多,毛细胞凋亡率显著增大,呈现明显的量效关系(P0.01)。3.Western blot检测结果显示,对照组小鼠耳蜗GRP78和caspase-12的蛋白表达微弱,而CDDP组小鼠耳蜗上述蛋白表达水平均较对照组明显增高(P0.01),并且随着CDDP浓度的逐渐增高而显著增强(P0.01)。加入TUDCA后,小鼠耳蜗中GRP78和caspase-12的蛋白表达水平较CDDP组明显降低(P0.01)。4.Western blot检测结果显示,对照组小鼠耳蜗IRE1、JNK1、JNK2和Bax的蛋白表达微弱,而CDDP组小鼠耳蜗上述蛋白表达水平均较对照组明显增高(P0.01),并且随着CDDP浓度的逐渐增高而显著增强(P0.01)。结论ERS相关蛋白GRP78、IRE1、JNK和caspase-12在CDDP干预后离体小鼠耳蜗中的高表达,提示ERS可能参与了CDDP诱导的小鼠耳蜗细胞凋亡,IRE1通路可能是ERS介导顺铂所致离体小鼠耳蜗细胞凋亡的途径之一。
【关键词】：内质网应激 顺铂 耳蜗 细胞凋亡 葡萄糖调节蛋白78 肌醇需求酶1
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.43
【目录】：

• 中文论著摘要4-7
• 英文论著摘要7-11
• 英文缩略语表11-13
• 前言13-16
• 实验材料与方法16-21
• 实验结果21-30
• 讨论30-34
• 结论34-35
• 本研究创新性的自我评价35-36
• 参考文献36-39
• 附录39-53
• 综述39-50
• 参考文献47-50
• 在学期间科研成绩50-51
• 致谢51-52
• 个人简介52-53

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本文编号：908649