小鼠诱导性多能干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究

发布时间：2017-10-02 03:33

  本文关键词：小鼠诱导性多能干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究

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【摘要】：研究背景:感音神经性耳聋是耳鼻喉科的常见疾病,其主要原因是由内耳毛细胞和/或螺旋神经元的损伤导致,然而在哺乳动物,以上二者的损伤是不可能再生与修复的,因此干细胞移植替代受损的毛细胞和/或螺旋神经元治疗由此引起的感音神经性耳聋已成为耳科学研究的重点和热点问题。目的:1.通过体外培养建立稳定的诱导性多能干细胞(i PSCs)培养体系;2.利用耳毒性药物制作小鼠感音神经性耳聋模型;3.利用显微注射法将经CM-Di1标记的i PSCs经圆窗移植入小鼠耳蜗,观察移植细胞在耳蜗内的存活、迁移、分化情况,为利用i PSCs移植治疗感音神经性耳聋提供理论依据。方法:1.i PSCs的培养与标记:利用贴壁培养法培养稳定传代的小鼠i PSCs,并用荧光染料CM-Di1标记。2.感音神经性耳聋模型的制作:利用幼鼠皮下连续注射新霉素,通过听性脑干反应检测小鼠听力损失情况。3.小鼠i PSCs耳蜗移植:取40只造模成功小鼠随机平均分为实验组A和对照组B,同时取20只同批次正常小鼠作为正常组C,A组利用显微注射法将标记的小鼠i PSCs经圆窗移植入耳聋鼠耳蜗的Rosenthal’s管中,B组注射等量的DMEM基础培养液,4周后处死A、B、C组小鼠各10只,通过免疫荧光染色法和RT-PCR法观察移植细胞在耳蜗内的存活、迁移与分化情况。剩余小鼠用于ABR阈值的连续性观察。4.i PSCs移植后耳蜗HE染色鉴定是否有畸胎瘤形成。结果:1.成功建立稳定的小鼠i PSCs培养体系,并能在体外培养形成EB,RT-PCR可检测i PSCs多能性基因Nanog,Oct4,Sox2。2.连续皮下注射新霉素12天后,小鼠反应阈达70-80d Bn HL。3.A组和B组术后ABR阈值无改善。A组蜗轴和Rosenthal’s管中均可见红色标记的i PSCs,并且部分细胞表达毛细胞标记物和螺旋神经元标记物。B、C组耳蜗内未见红色荧光表达。4.各组小鼠术前、术后ABR阈值差异无统计学意义。5.HE染色鉴定i PSCs移植后耳蜗暂未见畸胎瘤形成。结论:1.本实验可成功建立稳定的小鼠i PSCs培养体系。2.CM-Di1可用于体外细胞转染和体内细胞的示踪。3.新霉素可诱导小鼠感音神经性耳聋,建立稳定的耳聋模型。4.小鼠i PSCs耳内移植后可分化为表达毛细胞标志物的毛细胞样细胞。5.小鼠i PSCs耳内移植后可分化为表达螺旋神经元标志物的螺旋神经元样细胞。6.经Rosenthal’s管径路移植i PSCs不能明显改善耳聋鼠的ABR阈值。7.小鼠i PSCs移植后短期内未见畸胎瘤形成。8.移植后的i PSCs主要分布于Rosenthal’s管和蜗轴中。
【关键词】：诱导性多能干细胞 内耳移植 毛细胞 螺旋神经元 细胞分化
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.43
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 引言11-14
• 第2章 材料与方法14-30
• 2.1 实验材料14-18
• 2.1.1 实验细胞与实验动物14
• 2.1.2 实验试剂14-16
• 2.1.3 实验主要培养液的配制16-17
• 2.1.4 实验仪器和实验耗材17-18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 实验器材的准备与实验分组18-19
• 2.2.2 原代MEF的制备、培养与冻存19-20
• 2.2.3 MEF的复苏、传代和饲养层细胞的制备20-21
• 2.2.4 小鼠iPSCs的复苏、传代与冻存21-22
• 2.2.5 小鼠iPSCs的鉴定22-24
• 2.2.6 小鼠iPSCs的分离及CM-Di1的标记24
• 2.2.7 小鼠感音神经性耳聋模型的制作24
• 2.2.8 术前及术后小鼠ABR检测24-25
• 2.2.9 耳蜗内移植CM-Di1标记的小鼠iPSCs25
• 2.2.10 耳蜗的免疫学检测25-26
• 2.2.11 耳蜗的基因学检测26-28
• 2.2.12 移植后耳蜗的HE染色28-29
• 2.3 实验数据的统计分析29-30
• 第3章 结果30-43
• 3.1 原代MEF的形态及饲养层细胞的特点30
• 3.2 小鼠iPSCs的形态及生长特点30-31
• 3.3 小鼠iPSCs的多能性检测结果31-32
• 3.4 CM-Di1标记小鼠iPSCs32
• 3.5 ABR检测结果及分析32-35
• 3.6 iPSCs在小鼠耳蜗内的分化表达情况35-42
• 3.6.1 耳蜗毛细胞标志物（Myosin7a、Math1、Calretinin）免疫荧光染色结果35-38
• 3.6.2 耳蜗螺旋神经元标志物（ Nestin、Neurofliment Medium、Tubulinβ-Ⅲ）免疫荧光染色结果38-41
• 3.6.3 RT-PCR检测耳蜗毛细胞及螺旋神经元相关基因的表达情况41-42
• 3.7 HE染色鉴定小鼠iPSCs耳蜗内移植后的成瘤性42-43
• 第4章 讨论43-46
• 第5章 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-52
• 攻读学位期间的研究成果52-53
• 综述53-59
• 参考文献58-59

【参考文献】

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本文编号：957354