先天性小耳畸形相关差异表达基因的筛选与验证研究

发布时间：2017-10-02 19:30

  本文关键词：先天性小耳畸形相关差异表达基因的筛选与验证研究

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【摘要】：目的：通过对先天性小耳畸形残耳软骨组织及对侧正常耳软骨组织的芯片检测,筛选小耳畸形相关差异表达基因,通过生物信息学分析选择部分与小耳畸形关系较密切的基因,通过qRT-PCR和Western blotting方法进一步验证其表达变化,为深入研究先天性小耳畸形的分子机制及其防治提供科学依据。方法：标本源于中国医学科学院整形外科医院收治的单侧先天性小耳畸形患者。患耳均无感染及软骨炎等征象。每例标本均于手术过程中取残耳软骨组织(术中剔除的部分,约100mg)和正常侧(耳颅角较大侧)耳软骨组织(术中废弃的部分,约100mg),其中以残耳软骨组织为实验组,正常侧耳软骨组织为对照组。取材后立即将软骨组织于液氮中保存或直接提取总RNA和总蛋白。通过美国Agilent公司的Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0筛选单侧先天性小耳畸形患者残耳软骨组织(实验组)和正常侧耳软骨组织(对照组)的差异表达基因,根据生物信息学分析选择与小耳畸形更为相关的ZNF44、Wdr82和FGFR2基因,通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和Western blotting方法进一步验证其表达情况。结果：1.对照组和实验组软骨组织RNA质检结果显示：OD260/280值分别1.95、1.86、1.85、1.87、1.88和1.88,28S和18S条带清晰,无基因组DNA污染。提取的RNA具有良好的完整性和纯度。2.从杂交图上可见密集的cy3绿色荧光呈规则的圆形,杂交点间没有重叠现象,信号明显,图像背景低,无灰尘噪声信号。3.芯片数据分析结果显示：先天性小耳畸形软骨组织中差异表达基因共553条,其中表达下调的基因433条,如锌指蛋白44 (zinc finger protein 44, ZNF44)基因和WD40重复蛋白82 (WD40 repeat protein 82, Wdr82)基因分别下调2.00倍和3.65倍,表达上调的基因120条,如成纤维细胞生长因子2 (fibro-blast growth factor 2, FGF-2)基因上调2.64倍。这些差异表达基因涉及胚胎发育、肢体形成、骨骼发育及信号转导等生物学事件。4. qRT-PCR方法验证差异表达基因mRNA水平的表达,结果显示：与对照组相比,实验组软骨组织中ZNF44 (t=5.398, P0.01)和Wdr82 (t=5.519, P0.01)基因表达下调,而FGFR2 (t=4.588, P0.01)基因表达上调。与芯片结果一致。5. Western blotting法验证差异表达基因蛋白水平的表达,结果显示：与对照组相比,实验组软骨组织中ZNF44 (t=4.396, P0.05)和Wdr82 (t=6.910, P0.01)基因表达下调,而FGFR2 (t=13.187,P0.01)基因表达上调。与芯片结果和qRT-PCR结果一致。结论：1.小耳畸形残耳软骨组织与对侧正常软骨组织比较,mRNA表达谱发生了较大的改变。2. ZNF44、Wdr82和FGFR2等相关基因参与的生物过程、分子功能、信号通路可能与先天性小耳畸形发病有关。
【关键词】：先天性小耳畸形 差异表达基因 锌指蛋白44基因 WD40重复蛋白82基因 成纤维细胞生长因子2基因
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 一、前言8-9
• 二、材料与方法9-22
• 三、结果22-25
• 四、讨论25-28
• 五、结论28-29
• 附图29-33
• 参考文献33-36
• 文献综述36-43
• 参考文献40-43
• 致谢43-44

【参考文献】

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1 陈佳鹏;张蕾;陈功;宋新明;郑晓瑛;;中国1993-1998年出生缺陷监测能力分析[J];中华流行病学杂志;2006年05期

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本文编号：961444