鼻咽癌细胞中14-3-3σ相关miRNAs差异表达谱研究

发布时间：2017-10-04 01:27

  本文关键词：鼻咽癌细胞中14-3-3σ相关miRNAs差异表达谱研究

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【摘要】：[目的]通过mi RNA芯片技术获得14-3-3σ(SFN)所调控的mi RNAs差异表达谱;通过RT-PCR技术验证芯片结果的可靠性;生物信息学分析获得的mi RNAs差异表达谱所涉及的信号通路;阐明mi RNASFN之间的调控机制在鼻咽癌中的作用。[方法]构建14-3-3σ高表达的重组细胞系5-8F-14-3-3σ(+)以及对照组细胞系5-8F-14-3-3σ(-)。经过Western blot检测两组细胞中14-3-3σ蛋白表达水平,确定转染成功。收集细胞,提取RNA,检测总RNA纯度,通过mi RNA芯片检测SFN所调控的mi RNAs差异表达谱。mi Randa软件分析了下调倍数最大的10个靶mi RNAs的热动力学稳定性分值(mir SVR)和序列保守性分值(Phast Cons),确定SFN的靶mi RNAs。通过mi Rwalk在线软件进行预测和分析SFN的靶mi RNAs。结合基因芯片结果进行对比分析,找出SFN的靶mi RNA。Target Scan在线软件预测靶mi RNA和SFN的结合位点。对SFN的靶mi RNA进行q RT-PCR验证,与芯片结果进行比较。生物信息学分析14-3-3σ相关mi RNAs表达谱涉及到的信号通路、生物学过程、分子功能及细胞组分,从中找出关键的信号通路。[结果]1.Western blot检测5-8F-14-3-3σ(+)细胞中14-3-3σ蛋白的表达水平明显高于5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F细胞,而5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F两组间蛋白表达无明显差异。2.mi RNA芯片检测5-8F-14-3-3σ(+)和5-8F-14-3-3σ(-)两个细胞系之间的差异mi RNAs,获得14-3-3σ调控的mi RNAs差异表达谱。mi RNA芯片显示SFN高表达后有239个mi RNAs差异表达,其中上调的mi RNAs有58个,而下调的mi RNAs有181个。3.10个下调差异倍数最大的mi RNAs中,通过mi Randa软件分析发现符合条件的mi RNAs(mir SVR≤-0.1,Phast Cons 0.4~0.7)有2个。因此,mi R-675,mi R-4253可能是SFN的靶mi RNA。4.SFN的靶mi RNAs通过mi Rwalk在线软件进行预测和分析,结果发现:10个软件当中有6个软件同时预测到了mi R-145和mi R-220c可与SFN结合;有5个软件同时预测到了mi R-597,mi R-129-3p,mi R-603,mi R-769-3p,mi R-431,mi R-608,mi R-766,mi R-31,mi R-532-3p,mi R-675,mi R-922,mi R-329,mi R-483-3p,mi R-554,mi R-642,mi R-886-5p,mi R-362-3p,mi R-486-3p等18个mi RNAs可与SFN结合。与基因芯片结果对比分析,发现,mi R-675可能是SFN作用的靶mi RNA。5.Targetscan软件预测mi R-675与SFN结合的位点,发现该结合位点位于SFN基因226-232碱基,其结合的序列是5'-CCGCACC-3'与mi R-675部分序列一致。mi RNA通过结合到SFN基因的3`-UTR,调控SFN的表达,两者的结合具有特异性,进一步说明SFN可能是mi R-675的可靠的作用靶基因。6.生物信息学分析发现,差异mi RNAs调控的靶基因当中,涉及到的信号通路主要包括WNT、MAPK、TGF-β。7.RT-PCR验证mi R-675和mi R-4253的表达水平,mi R-675和mi R-4253在5-8F-14-3-3σ(+)中表达量分别为对照组5-8F-14-3-3σ(-)的-3.458和-5.098倍,与基因芯片结果一致。表明基因芯片结果检测可靠。[结论]1.获得了14-3-3σ调控的mi RNAs表达谱,在鼻咽癌细胞中14-3-3σ表达增高后,上调的mi RNAs有58个,下调的mi RNAs有181个;2.生物信息学分析结果表明,14-3-3σ相关mi RNAs表达谱涉及到的功能复杂,其中WNT、MAPK、TGF-β信号通路可能与鼻咽癌发生发展有关;3.mi R-675能与14-3-3σ结合,是14-3-3σ的靶mi RNA;SFN可能是mi R-675的基因,mi R-675-SFN相互调控在鼻咽癌发生发展中具有重要作用。
【关键词】：鼻咽癌 miRNAs差异表达谱 14-3-3σ miR-675 生物信息学
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 主要缩略英文索引13-15
• 第1章 绪论15-21
• 1.1 鼻咽癌发病与诊疗现状15-16
• 1.2 miRNA与肿瘤关系16-17
• 1.3 1433σ 研究进展17-18
• 1.4 差异miRNA芯片在肿瘤研究中的应用18-19
• 1.5 研究内容19-21
• 第2章 材料与方法21-33
• 2.1 材料21-24
• 2.2 实验方法24-33
• 第3章 结果33-57
• 3.1 重组细胞中 1433σ 蛋白表达水平33
• 3.2 细胞总RNA的抽提结果33-34
• 3.3 基因芯片检测差异表达miRNAs34-40
• 3.4 靶基因与miRNAs之间的结合特异性及稳定性预测40-41
• 3.5 生物信息学分析SFN的靶miRNAs41-42
• 3.6 预测miR-675和SFN的结合位点42-43
• 3.7 差异表达mi RNAs的生物信息学分析43-54
• 3.8 RT-PCR检测miR-675，，mi R-4253表达水平54-57
• 第4章 讨论57-67
• 4.1 mi RNA在鼻咽癌中的研究现状57
• 4.2 1433σ 与肿瘤关系57-59
• 4.3 1433σ 的miRNAs差异芯片结果分析59
• 4.4 1433σ 调控的mi RNAs分析59-60
• 4.5 miR-675与肿瘤研究现状60-61
• 4.6 1433σ 调控的mi RNAs的功能分析61-62
• 4.7 miRNAs涉及到的信号通路在鼻咽癌中的作用62-67
• 第5章 结论67-69
• 参考文献69-81
• 文献综述81-91
• 参考文献86-91
• 附录91-101
• 攻读学位期间的科研成果101-103
• 本研究基金资助项目103-105
• 致谢105-106

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