FKBP51在小鼠肝脏纤维化中的作用以及分子机制的探究

发布时间：2017-10-10 11:00

  本文关键词：FKBP51在小鼠肝脏纤维化中的作用以及分子机制的探究

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【摘要】：[目的]肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化、肝癌发展的必经阶段,是所有慢性肝病的共同病理基础。虽然肝纤维化发病率高,但目前对其发病机制尚不完全清楚,且无有效的根本的抗纤维化治疗药物。本论文第一部分通过创建FKBP51基因敲除小鼠肝脏纤维化模型,研究FKBP51在肝脏纤维化中的作用,以期寻找预防和治疗肝脏纤维化的新的靶点。[方法]通过创建FKBP51基因敲除(KO)小鼠肝脏纤维化模型,分析FKBP51基因的缺失对肝脏的影响。1) FKBP51基因敲除小鼠的肝脏纤维化模型创建。将实验小鼠分为四组,分别为注射橄榄油的野生型(WT)小鼠(WT-Con)、注射橄榄油的FKBP51基因敲除小鼠(KO-Con)、注射四氯化碳的野生型小鼠(WT-CCL4)、注射四氯化碳的FKBP51基因敲除小鼠(KO-CCL4),腹腔注射,每周三次,持续两周；2)肝脏表观病理观察。对肝脏取材后观察四组肝脏的色泽、质地以及表面光滑度；3)肝脏病理学分析。对四组小鼠肝脏切片,分别进行HE染色,Masson染色,纤维化程度分析,来研究WT和KO小鼠肝脏组织病理学变化；4)利用Real-time实验,对与肝脏纤维化相关的分子进行检测；5)免疫组化实验。对纤维化标志分子进一步进行验证：6)测定细胞凋亡。对四组小鼠的肝脏切片进行细胞凋亡的检测;7)免疫印迹实验。对四组小鼠肝脏组织中的自噬、代谢、TGF-p通路相关基因进行检测。[结果]1)通过免疫组织化学方法鉴定证明成功构建了WT和KO肝脏纤维化动物模型；2)通过对肝脏表观进行观察发现：CCL4处理组中,WT小鼠肝脏色泽暗淡,质地硬,表面粗糙,布满小颗粒纤维化结节,而FKBP51KO小鼠肝脏色泽较淡,质地较硬,表面较粗糙,布满少量小颗粒纤维化结节,比野生型小鼠纤维化程度轻；3)肝脏病理学分析发现：CCL4处理组中,WT小鼠肝细胞变性坏死,汇管区可见大量纤维组织增生且炎症细胞多,而FKBP51KO小鼠炎症细胞少且胶原沉积少；4)通过Real-time和免疫组化实验发现,Collagen I、 TIMP1、 CTGF和a-SMA等纤维化标志蛋白在FKBP51基因敲除小鼠中的表达明显少于野生型小鼠,且与肝脏纤维化Marker相关的细胞因子CTGF、 IL6、 INF-Υ、 TGF-β、 TNF-α也出现此趋势；5)通过对WT和KO小鼠肝脏进行凋亡测定实验发现,FKBP51基因敲除小鼠肝脏凋亡细胞很少,细胞中几乎无胞核固缩、染色质边聚、胞核染成棕黄色等凋亡现象,而野生型小鼠肝脏细胞出现大量凋亡细胞：6)免疫印迹实验发现：FKBP51基因敲除小鼠自噬较WT相比明显加强,而与纤维化相关的TGF-β中的通路分子在KO小鼠中明显被抑制。[结论]FKBP51参与TGF-β通路介导的CCL4诱导的肝脏纤维化过程,FKBP51K0小鼠抵御CCL4诱导的肝脏纤维化。[目的]通过分析野生型小鼠(WT)与Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝脏、海马RNA表达谱系之间的差异,研究Fkbp51基因在代谢通路和神经通路中的作用。[方法]利用第二代测序技术对Fkbp51KO与WT小鼠的肝脏与海马mRNA进行表达谱测序,将测序结果用BRB-ArrayTools进行分析,筛选出小鼠肝脏与海马的差异基因,然后分别利用在线工具DAVID对差异基因进行GO本体分析,STRING数据库对其进行蛋白质的相互作用网络分析,并利用Genecard对基因进行注释。[结果](1) Fkbp51的缺失,在肝脏中造成类固醇生物合成及代谢、脂类物质代谢以及氧化还原反应等相关基因表达水平的变化：(2)在海马中造成机械刺激探测、学习或记忆、突触传递的调节、PPAR信号通路、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等相关基因表达水平的变化；(3)在肝脏与海马中,Fkbp51的缺失同时造成了11个基因的共差异表达,这11个基因的蛋白网络互作图显示：HMGCS2与INSIG1及相关蛋白形成网络,而USP2与PER、 CRY、 DBP等相关蛋白形成另一个网络。这两个网络既参与代谢也参与神经调节。[结论]Fkbp51在代谢与神经中的作用既是相互独立又是相互联系的。
【关键词】：FKBP51基因敲除小鼠 肝脏纤维化 TGF-β通路 Fkbp51 基因敲除小鼠 肝脏 神经系统 RNA-seq
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 英文缩略表4-5
• 引言5-6
• 第一部分 Fkbp51在小鼠肝脏纤维化中的作用以及分子机制的探究6-45
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-16
• 实验材料16-19
• 实验方法19-29
• 实验结果29-42
• 讨论42-44
• 结论44-45
• 第二部分 Fkbp51基因敲除小鼠肝脏与大脑海马区RNA表达谱系的分析比较45-62
• 摘要45-46
• Abstract46-47
• 前言47-48
• 实验材料48-49
• 实验方法49-50
• 实验结果50-59
• 讨论59-61
• 结论61-62
• 参考文献62-66
• 致谢66-67
• 个人基本情况67-68
• 硕士期间论文发表情况及学术表现68-69

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本文编号：1005965