黑根霉胞外多糖对MNNG致小鼠慢性萎缩性胃炎的抑制作用
本文关键词：黑根霉胞外多糖对MNNG致小鼠慢性萎缩性胃炎的抑制作用
【摘要】：慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis, CAG)是一种常见的消化系统疾病,该病症严重影响患者的消化功能。CAG的发生伴随肠上皮化生和异型性增生,此二者在临床上是胃癌癌前病变的重要指标。目前临床上治疗CAG的药物只能消除胃黏膜病变部位的炎症和缓解疼痛,多数治疗药物存在药物依赖和损伤其它器官等不良反应。因此,寻找治疗效果显著、毒副作用小且能提高机体免疫能力的药物具有重要意义。真菌多糖具有抗氧化、抗炎症、提高机体免疫能力等活性。黑根霉(Rhizopus nigricans)是一种接合菌类丝状真菌,在液体发酵过程中可产生大量胞外多糖。在前期研究中,本课题组从黑根霉发酵液中分离出粗多糖EPS,在体外可抑制人结肠癌HCT-116细胞及人白血病K562细胞的增殖。EPS可以通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡。EPS也能够抑制S180荷瘤小鼠的肿瘤生长,提高小鼠免疫能力,延长S180荷瘤小鼠的存活时间。本研究通过建立CAG小鼠模型,研究EPS对由1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)诱导小鼠CAG的作用。1.EPS治疗给药对MNNG诱导小鼠的作用,实验选取5周龄雄性BALB/c小鼠并随机分为对照组、MNNG组(MNNG 66.7 mg/kg/d)和MNNG+EPS组(MNNG 66.7 mg/kg/d、EPS 75 mg/kg/d),每组5只,实验进行20周后测定相关指标。实验结果表明,第20周,MNNG组小鼠平均体重(28.34±0.9 g)及进食量(168.5 g)小于对照组小鼠平均体重(34.4±1.1 g)及进食量(189 g)；MNNG+EPS组小鼠平均体重(30.04±0.8 g)及进食量(174 g)大于MNNG组。小鼠胃组织和肝组织病理学检查结果表明,对照组小鼠胃黏膜腺体完整,肝组织细胞完整、形态规则无细胞间隙；MNNG组小鼠胃腺体萎缩并伴有胃黏膜肌层增生现象,胃内出现多处出血点,肝组织细胞形态不规则,细胞间隙较大；MNNG+EPS组小鼠胃黏膜仅出现黏膜充血未出现明显肌层增生现象,多数肝细胞形态完整,细胞间隙较小。小鼠免疫器官指数测定结果表明,MNNG组胸腺指数(0.59±0.002mg/g)和脾脏指数(3.49±0.02mg/g)小于对照组,该组小鼠免疫能力降低；MNNG+EPS组胸腺指数(0.68±0.002mg/g) (P0.05)和脾脏指数(3.55±0.02mg/g)均高于MNNG组。各组小鼠肝肾功能检测结果表明,MNNG组天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase, AST)含量(163.0±13.5 U/1)低于对照组,MNNG+EPS组AST含量(183.0±40.0 U/1)高于MNNG组；血清肌酐(Serum creatinine, Cr)含量(31.4±4.67 mg/dl)和血尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)含量(11.0±0.99 mg/dl)高于对照组；MNNG+EPS组MNNG组Cr(28.8±8.41 mg/dl)和BUN (9.5±1.17 mg/dl)含量低于MNNG组。上述结果说明,EPS多糖治疗给药方式可有效抑制小鼠CAG的发生和病症的发展。2.EPS预防给药对MNNG诱导小鼠CAG的作用,实验选取5周龄雄性BALB/c小鼠并随机分为对照组、MNNG组(MNNG 133 mg/kg/d)和MNNG+EPS组(MNNG 133 mg/kg/d、EPS 200 mg/kg/d),每组8只,实验前2周MNNG+EPS组小鼠仅饮用EPS水溶液,其他组别自由饮水,2周之后再按照上述方法进行实验,并持续到第20周,之后测定相关指标。小鼠体征及外观形态观察结果表明,对照组小鼠体型肥硕,背毛浓密有光泽,无竖毛现象,四肢抓握力量大；MNNG组小鼠体型瘦小,背毛稀疏存在竖毛现象,四肢几乎无抓握能力；MNNG+EPS组小鼠体型适中,背毛浓密无光泽无竖毛现象,四肢抓握力量小。各组小鼠胃黏膜溃疡指数评定分级结果表明,对照组患中、重度CAG的小鼠比例为0/8, MNNG组患中、重度CAG的小鼠比例为5/8,MNNG+EPS组患中、重度CAG的小鼠比例为2/8。各组小鼠胃组织细胞中与CAG形成相关基因COX-2和EGF mRNA表达量差异结果表明,对照组COX-2和EGF表达量较低,MNNG组COX-2和EGF的表达量要高于对照组,MNNG+EPS组COX-2和EGF表达量低于MNNG组但高于对照组。上述结果说明,EPS多糖预防给药方式可有效抑制小鼠CAG的发生和病症的发展,实验结果与治疗给药方式结果大致相同。3.磺酰罗丹明B(SRB)染色法探究EPS对MNNG处理人肝细胞的影响。利用不同剂量的EPS (0.1、0.3、0.5 mg/mL)与MNNG (0.05 mg/mL)共同孵育人肝细胞20 h。实验结果表明,EPS能够提高肝细胞活性,并存在EPS剂量依赖关系。不同剂量的EPS与肝细胞共同孵育不会抑制肝细胞的生长和增殖。综上所述,EPS可以在体外保护MNNG导致的肝细胞损伤,能够抑制小鼠CAG的形成,提高小鼠免疫能力,抑制MNNG对小鼠肝、肾脏器的损伤。
【关键词】：黑根霉 胞外多糖 MNNG 慢性萎缩性胃炎
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R573.32
【目录】：
- 摘要7-9
- Abstract9-12
- 本文缩略词12-13
- 1 前言13-24
- 1.1 引起慢性萎缩性胃炎发病的因素13-14
- 1.1.1 幽门螺杆菌感染13-14
- 1.1.2 胆汁反流14
- 1.1.3 高盐和低维生素的饮食习惯14
- 1.1.4 遗传因素14
- 1.1.5 其他因素14
- 1.2 慢性萎缩性胃炎的发病特点14-15
- 1.3 慢性萎缩性胃炎与胃癌的关系15-16
- 1.4 慢性萎缩性胃炎的临床检查方法16-17
- 1.4.1 胃镜检查16
- 1.4.2 常规检查16-17
- 1.4.3 组织活检检查17
- 1.4.4 影像学检查17
- 1.5 慢性萎缩性胃炎的治疗方法17-18
- 1.6 建立慢性萎缩性胃炎动物模型的常见方法18-20
- 1.6.1 幽门螺杆菌感染造模法18-19
- 1.6.2 化学制剂诱导造模法19
- 1.6.3 混合造模法19-20
- 1.7 以MNNG作为诱导物建立慢性萎缩性胃炎动物模型的理论依据20
- 1.8 多糖治疗慢性萎缩性胃炎的研究进展20-21
- 1.9 真菌多糖的研究前景及挑战21-22
- 1.10 黑根霉胞外多糖的研究进展22-23
- 1.11 本实验课题研究的意义23-24
- 2 实验试剂与仪器24-26
- 2.1 实验动物及细胞24
- 2.2 实验材料与试剂24-25
- 2.3 实验仪器25-26
- 3 实验方法26-34
- 3.1 黑根霉胞外多糖提取及纯化26
- 3.2 黑根霉胞外多糖含量测定26-27
- 3.3 溶液的配制27
- 3.4 治疗给药实验27-28
- 3.5 预防给药实验28
- 3.6 小鼠体重及进食量变化28
- 3.7 小鼠脏器指数测定28
- 3.8 小鼠胃组织及肝组织病理学分析28-30
- 3.8.1 小鼠胃黏膜形态病理分析28-29
- 3.8.2 HE染色法对小鼠胃、肝组织进行病理分析29-30
- 3.9 小鼠肝肾功能分析30
- 3.10 半定量PCR检测各组小鼠胃组织细胞中COX-2和EGF基因的mRNA表达水平30-32
- 3.10.1 总RNA的提取30-31
- 3.10.2 cDNA的合成31
- 3.10.3 引物设计31
- 3.10.4 PCR反应31-32
- 3.10.5 琼脂糖凝胶电泳32
- 3.11 小鼠外观状态与体征变化32
- 3.12 小鼠体温测定32
- 3.13 小鼠胃组织病理学评定32-33
- 3.14 磺酰罗丹明B染色法检测EPS及EPS和MNNG对人肝细胞的影响33
- 3.15 数据统计处理33-34
- 4 实验结果与分析34-50
- 4.1 黑根霉胞外多糖治疗给药对MNNG诱导慢性萎缩性胃炎的抑制作用34-42
- 4.1.1 黑根霉胞外多糖含量测定结果34
- 4.1.2 小鼠体重及进食量变化统计结果34-36
- 4.1.3 小鼠胸腺指数及脾脏指数测定结果36
- 4.1.4 小鼠胃黏膜形态变化分析36-37
- 4.1.5 小鼠胃组织及肝组织病理学分析37-40
- 4.1.6 小鼠血清中AST、Cr及BUN测定结果40-41
- 4.1.7 小鼠胃组织COX-2和EGF基因的mRNA表达水平41-42
- 4.2 黑根霉胞外多糖预防给药对MNNG诱导慢性萎缩性胃炎的抑制作用42-48
- 4.2.1 小鼠外观状态及体征变化结果分析42-43
- 4.2.2 小鼠体温测定结果43-44
- 4.2.3 小鼠胃黏膜溃疡指数分级评定结果44-45
- 4.2.4 小鼠胃组织及肝组织病理学分析45-47
- 4.2.5 小鼠胃组织COX-2和EGF基因mRNA表达水平47-48
- 4.3 EPS对由MNNG引起人肝细胞损伤的保护作用48-50
- 5 讨论50-54
- 5.1 黑根霉胞外多糖对慢性萎缩性胃炎的抑制作用50-52
- 5.2 推测黑根霉胞外多糖抑制慢性萎缩性胃炎形成的机制52-54
- 6 小结54-55
- 7 参考文献55-61
- 8 致谢61-62
- 学位论文评阅及答辩情况表62
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10 钟e，
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