TNFAIP8L2在肝纤维化中的作用及机制探讨

发布时间：2017-10-18 23:24

  本文关键词：TNFAIP8L2在肝纤维化中的作用及机制探讨

  更多相关文章： 肝纤维化 TNFAIP8L2 LX-2 TGF-β1 Smad

【摘要】：目的近年来,越来越多的国家面临肝纤维化的困扰,肝纤维化已成为一个重要的全球卫生问题,研究并揭示其发生的确切分子机制成为防治该疾病的重要课题。肝纤维化的形成是一个动态过程,各种损伤因子刺激机体以后首先引起机体肝组织的炎症反应,之后炎症反应激活免疫细胞分泌趋化因子、TGF-β1等细胞因子作用于人的肝星状细胞,使肝星状细胞转变成为活化状态的肌纤维母细胞,最终使其纤维Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白,蛋白聚糖和糖蛋白等细胞外基质增多,形成肝纤维化。现研究已知,TGF-β1激活的Smad信号通路是引起肝纤维化的经典通路,抑制Smad信号通路可以有效阻断该疾病的发生。研究并发现新的调控肝纤维化的分子,对揭示肝纤维化形成的分子机制及干预肝纤维化的进展与疾病转归意义重大。TIPE2 (Tumor necrosis factor-α-induced protein-8-like-2, TNFAIP8L2)即肿瘤坏死因子a诱导蛋白8型2,与TIPE1 (TNFAIP8L1, TNF-α-induced protein 8-like 1)、TIPE (TNFAIP8)、TIPE3 (TNFAIP8L3)同为肿瘤坏死因子α诱导蛋白8家族(TNFAIP8)成员,结构上具有一定的同源序列。作为一个新型的抑炎分子,TIPE2在抑制炎症反应、维持机体免疫系统的平衡中发挥着重要的调节作用。各种原因造成的炎症反应是引起肝纤维化的病理基础,因而炎症反应往往在该疾病中发挥至关重要的作用。而TIPE2作为一个新型的抑炎分子,是否在肝纤维化过程中发挥一定的作用,其作用机制如何,目前尚未有文献报道。为此,本课题利用CCl4诱导TIPE2敲基因(TIPE2-/-)小鼠与野生型C57小鼠建立肝纤维化动物模型,对比研究TIPE2在肝纤维化中的作用,进而利用TGF-β1刺激肝星状细胞系LX-2细胞,研究TIPE2调控肝纤维化的分子机制,并探讨TIPE2调控肝纤维化的细胞信号通路,以期明确TIPE2在该疾病中的作用并揭示其机制,为阐明该疾病的发生机制及临床利用免疫调控分子干预治疗该疾病奠定一定的实验基础。研究方法1.体内实验研究TIPE2在肝纤维化模型中的作用1.1建立肝纤维化模型取6-8周的C57雄性小鼠,将其随机分为两组,模型组(n=20)每周两次腹腔注射给药(20%四氯化碳溶液,每g体重注射5μl),对照组(n=20)每周两次腹腔注射给药(橄榄油,每g体重注射5μl)。在第四周时,眼球取血4000 r/min离心10分钟后取上清,用流式细胞仪检测小鼠血清中MCP-1、TNF-α与IL-6等细胞因子的表达水平,用酶标仪与分光光度计检测AST与ALT的表达,ELISA方法检测TGF-β1的表达。在第二周与第四周时,小鼠常规方法处死后PBS灌流,取一份新鲜肝组织留待分子生物学检测,一份肝组织(经福尔马林固定)制备成病理切片后用HE染色、Masson染色的方法分析其胶原沉淀形成情况,并综合判断肝纤维化形成情况。1.2肝纤维化模型组织中TIPE2的表达检测上述肝组织切片以TIPE2 (JinSiTe,1:200), α-actin (Abcam,1:200), TGF-β1 (Abcam,5μg/ml)为一抗；SP-9000 (ZSGB-BIO)为二抗,免疫组化检测TIPE2、 α-actin、TGF-β的表达,新鲜肝组织用于western blot检测TIPE2的表达,统计分析TIPE2表达强度与肝纤维化程度之间的相关性。1.3利用TIPE2-/-小鼠诱导模型验证TIPE2在肝纤维化中的作用取6-8周龄TIPE2-/-(n=10)小鼠,每周一次腹腔注射5%四氯化碳溶液(每g体重注射10μl)诱导肝纤维化模型,并以野生型C57小鼠为对照。第四周时,眼球取血后离心获得血清,检测血清中的MCP-1、TNF-α与IL-6等细胞因子；小鼠常规方法处死后PBS灌流,将肝组织(经福尔马林固定)制备成病理切片后用Masson染色的方法分析其胶原沉淀形成情况。1.4生存率分析取6-8周龄TIPE2-/-(n=10)小鼠与C57小鼠(n=10),每周两次腹腔注射给药(20%四氯化碳溶液,每g体重注射20μl),动态观察其生活状态,并记录其体重变化及死亡情况,至12周时常规方法处死小鼠,绘制生存曲线。2.体外实验2.1 LX-2细胞培养人肝星状细胞系LX-2细胞(广州Jennio生物科技有限公司)培养于含10%血清的RIPA1640培养基中,培养条件为37℃、5%二氧化碳、湿润空气。2.2检测TIPE2在LX-2细胞中的表达将LX2铺到6孔板中(4×105个细胞/孔)培养14个小时后对LX2细胞进行不同浓度、不同时间的TGF-β1刺激。以不同浓度(0,2.5,5,10,20ng/ml)的TGF-β1刺激一定时间后,用western blotting与real-time PCR的方法分别在蛋白水平和mRNA水平检测TIPE2的表达,筛选TGF-β1刺激TIPE2表达的最佳作用浓度,再以筛选出的最佳浓度(10ng/ml)的TGF-β1分别刺激0、12、24、48小时,检测TIPE2表达以筛选TGF-β1的刺激TIPE2表达的最佳作用时间。2.3在LX-2细胞中研究TIPE2调控肝纤维化的机制将人LX-2培养于60 mm小皿中(1×106个细胞/ml),贴壁24 h后以Lipofectamine 2000转染TIPE2表达质粒pRK5-hTIPE2,通过用western blotting与real-time PCR的方法分别在蛋白水平和mRNA水平检测α-actin与MMP-2的表达来验证TIPE2在正常情况下和TGF-β1刺激情况下对肝纤维化的影响。为探讨TIPE2在LX-2细胞中的机制,我们在正常表达TIPE2与过表达TIPE2的LX-2细胞中用TGF-β1刺激细胞,western blotting的方法检测了Smad3、ERK、 IκB与JNK的磷酸化水平。2.4研究TIPE2调控Smad信号通路是否依赖于Rac1众所周知,TIPE2是Rac1的抑制分子。为研究TIPE2调控Smad信号通路是否依赖于Rac1,我们利用了Rac1抑制剂(NSC23766)检测Smad3的活性。研究结果1.体内实验结果1.1肝纤维化小鼠模型中TIPE2表达显著上调用HE与Masson染色的方法分析肝纤维化情况,结果显示,肝纤维化模型组中炎症细胞浸润明显,肝组织内胶原蛋白的沉积较正常对照小鼠的肝组织显著升高,同时,促肝纤维化分子a-actin显著升高、抑纤维化分子MMP-2显著下降,炎症因子(MCP-1、TNF-α与IL-6)显著升高。以上结果说明肝纤维化动物模型诱导成功。用免疫组化与western blotting的方法检测了肝纤维化模型肝组织中TIPE2的表达,结果发现,在肝纤维化模型中TIPE2表达显著上调,并且TIPE2表达强度与肝纤维化程度之间呈现正相关。此结果说明TIPE2在肝纤维化形成中发挥重要作用。1.2 TIPE2基因缺失加重肝纤维化用Masson染色的方法对比分析C57与TIPE2-/-小鼠模型中的肝纤维化程度,结果显示,TIPE2基因缺失后肝纤维化动物模型中肝脏的炎症明显较野生型小鼠模型严重,胶原蛋白的沉积亦明显高于C57小鼠。用流式细胞术的方法检测到TIPE2基因缺失模型小鼠中血清细胞因子水平(MCP-1与TNF-a)也显著高于C57模型小鼠,此结果说明TIPE2在肝纤维化形成中发挥保护作用。1.3 TIPE2基因缺失降低小鼠的生存率同时给TIPE2-/-小鼠与C57小鼠腹腔注射同等剂量的四氯化碳诱导肝纤维化形成,对比分析二者的生存率,结果发现,C57小鼠生存率显著高于TIPE2-/-小鼠。2.体外实验结果2.1 TIPE2在TGF-β1诱导的LX-2细胞中显著上调我们用western blotting与real-time PCR的方法检测TIPE2在LX-2细胞中的表达情况,结果发现LX-2细胞中TIPE2在TGF-β1存在时表达显著上调,且具有时间依赖性与浓度依赖性。2.2 TIPE2在TGF-β1诱导的LX-2细胞中下调α-actin、上调MMP-2通过用western blotting与real-time PCR的方法分别在蛋白水平和mRNA水平检测α-actin与MMP-2的表达来研究TIPE2在该疾病中的调控机制,结果显示,在过表达TIPE2的LX-2细胞中,经TGF-β1刺激后α-actin显著下调、MMP-2显著上调。2.3 TIPE2抑制LX-2细胞的Smad3、IκB与JNK信号通路Smad信号通路与NF-κB信号通路在该疾病中具有重要的作用。为探讨TIPE2在肝纤维化中的调控机制,我们用western blotting的方法检测TIPE2过表达的LX2细胞的Smad3、ERK、IκB与JNK的磷酸化水平。结果显示,在过表达TIPE2的LX-2细胞中,经TGF-β1刺激后Smad3、IκB与JNK的磷酸化水平显著下调。2.4 TIPE2调控Smad信号通路依赖于RaclTIPE2可以通过与Rac结合抑制NF-κB、MAPK细胞信号通路,为探讨在肝纤维化中TIPE2是否依赖于Rac1调控Smad信号通路,我们在转染了TIPE2的LX-2细胞中加入Rac1抑制剂,利用western blotting的方法检测Smad3的磷酸化水平,结果显示,TIPE2对Smad3磷酸化水平的抑制作用可以被Rac1抑制剂阻断。结论1.TIPE2在肝纤维化中发挥保护作用。2.TIPE2通过Rac1依赖的方式抑制Smad信号通路发挥抑制肝纤维化的作用。创新点及意义1.提出抗炎蛋白TIPE2在小鼠肝纤维化模型中发挥保护作用的创新性论断。2.提出TIPE2通过与Rac1结合抑制Smad信号通路调控肝纤维化的发生发展。3.目前尚没有治疗肝纤维化的有效方法,研究TIPE2在该疾病中的作用及其机制,可以发现肝纤维化的新的调控分子,为临床治疗肝纤维化以及针对肝纤维化的新药的开发提供新的思路。
【关键词】：肝纤维化 TNFAIP8L2 LX-2 TGF-β1 Smad
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 符号说明18-21
• 前言21-23
• 材料与方法23-32
• 实验结果32-36
• 讨论36-39
• 结论39-40
• 附图40-49
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 攻读学位期间发表学术论文目录55-56
• 学位论文评阅及答辩情况表56

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本文编号：1057735