厚壳贻贝脂质提取物对肠道损伤、溃疡性结肠炎以及类风湿性关节炎的影响和其机理研究
发布时间：2017-10-22 01:14
本文关键词：厚壳贻贝脂质提取物对肠道损伤、溃疡性结肠炎以及类风湿性关节炎的影响和其机理研究
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【摘要】：厚壳贻贝脂质提取物(HMLE)是以厚壳贻贝软体部分为原料,通过二氧化碳超临界萃取以及相关稳定化工艺而制得。针对其功效的研究,目前还局限于其抗关节炎方面,而且全部试验仍停留在动物模型的水平上,尚未在其他炎症性疾病模型中探索其抗炎作用和机理,也未在人体试验层面对其进行功效评价。目前HMLE在肠道炎症性疾病中的功效及机理研究还未见报道,因此基于细胞层面、动物层面和临床层面的系统研究将会为HMLE的抗炎功效提供更强有力的科学证据,同时也将为其应用领域的拓展提供理论基础。为发掘HMLE的抗炎功效,本文选取溃疡性结肠炎做为探索目标,从经典的体外炎症模型(脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症模型)开始探索,并着重观察其对与肠道疾病极其相关的TLR4/NF-κB通路的调控作用,继而在LPS攻毒致小鼠肠道损伤模型中探索其对肠道屏障的保护作用及其机理,最后再推进至小鼠溃疡性结肠炎模型中验证其功效并探索其作用机理,以期发掘其在溃疡性结肠炎的预防与治疗方面的潜力。此外,为补充]HMLE抗关节炎功效在人体研究上的缺乏,本文通过筛选纳入类风湿性关节炎患者,进行临床试食研究,以评价HMLE对该疾病患者临床症状改善的功效。其主要研究结果如下：(1)在脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中,摸索出HMLE在0-125 μg/mL浓度范围内无细胞毒性,且展现出良好的抑制一氧化氮(NO)释放、调节促炎／抗炎因子平衡以及下调TLR4/NF-κB通路中关键信号分子TLR4和MyD88基因表达的作用,并最终抑制核转录因子NF-κB的活化。显示出在肠道保护和肠道炎症性疾病方面的研究应用潜力。(2)在LPS攻毒所致小鼠肠道损伤模型中,HMLE和鱼油灌胃增补6周,可显著提升小鼠红细胞磷脂脂肪酸组成中EPA和DHA的比例。并且HMLE和鱼油均展现出良好的肠道保护作用,可显著改善小鼠回肠绒毛长度与隐窝深度的比值、缓解反映中性粒细胞浸润程度的结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的提升、缓解反映结肠组织损伤的血清二胺氧化酶(DAO)活性升高和结肠黏膜DAO活性降低、上调构成肠道机械屏障结构基础的紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的mRNA表达；免疫平衡方面,HMLE和鱼油均可从基因表达水平和蛋白分泌水平显著改善由LPS刺激导致的小鼠血清与结肠组织中免疫平衡的破坏；可显著下调LPS刺激导致的TLR4/NF-κB通路中TLR4和MyD88的mRNA表达的异常升高,但对其下游的IRAK4和TRAF6的mRNA表达无显著影响,而此并不影响HMLE和鱼油对于该通路终点NF-kB活化的抑制以及对MAPKs中p38 MAPK. JNK和ERK磷酸化的抑制。为进一步在小鼠溃疡性结肠炎模型中研究其抗结肠炎效果奠定了基础。(3)在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠慢性溃疡性结肠炎模型中,HMLE的灌胃增补可显著缓解结肠炎小鼠体重的降低和疾病活动指数的升高,其中HMLE高、中剂量组对维持小鼠的生存率也有一定效果,且高剂量HMLE对小鼠体重的维持效果优于阳性药物柳氮磺胺吡啶(SASP); HMLE增补和药物SASP治疗均有助于结肠炎小鼠结肠组织色泽、厚度、长度、重量、水肿、充血以及局部坏死等疾病指标的改善,并呈现一定的量效关系；HMLE增补和药物SASP治疗可显著改善结肠炎小鼠的结肠组织病理学评分,缓解炎性细胞浸润、绒毛坏死脱落、腺体水肿及灶点弥漫等病理变化,且HMLE高、中剂量组优于HMLE低剂量组；]3MLE增补和药物SASP治疗还可显著降低结肠炎小鼠结肠组织中的氧化应激水平、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)蛋白表达水平及其催化的NO释放水平、COX-2基因表达水平及其介导的前列腺素E2 (PGE2)的释放水平、促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-a的mRNA表达和蛋白分泌水平,其中HMLE对氧化应激的缓解效果优于SASP,且HMLE组内呈现一定的量效关系；HMLE和药物SASP均可下调结肠炎所引起的TLR4、MyD88、IRAK4和TRAF6的mRNA表达,以及抑制MAPKs通路中p38 MAPK、JNK和ERK的磷酸化,并抑制NF-kB的激活。(4)在为期6个月针对类风湿性关节炎患者的随机双盲试食研究中,HMLE配合药物可更有效地改善类风湿性关节炎患者的疾病活动评分和临床疾病活动指数,且无严重不良事件发生。无论是意向性(ITT)分析还是符合方案集(PP)分析,均指示HMLE组与安慰剂对照组存在显著的疗效差异；相比于安慰剂对照,HMLE增补对关节疼痛计数、关节肿胀计数和晨僵时间等临床指标也有更显著的改善作用。对患者血清炎症因子平衡的调控方面,试食结束后所有患者血清TNF-α、IL-1β和PGE2水平均显著下降,血清IL-10水平则显著升高,而血清IL-6水平却无显著变化；且TNF-α、IL-10和PGE2水平在试食前后的改善幅度存在显著的组间差异,HMLE组比安慰剂对照组的改善效果更为明显。综上所述,HMLE在体外细胞炎症模型、LPS致小鼠肠道屏障损伤模型、DSS致小鼠溃疡性结肠炎模型中均显示出良好的抗炎效果,并可能通过对TLR4/MAPKs/NF-kB通路的调控达到肠道保护和缓解溃疡性结肠炎症状的作用；此外,增补HMLE还对类风湿性关节炎患者具有缓解临床疾病活动度的作用。因此,HMLE有极大的潜力成为预防和治疗溃疡性结肠炎以及类风湿性关节炎的功能性油脂。
【关键词】：厚壳贻贝脂质提取物 肠道损伤 溃疡性结肠炎 类风湿性关节炎 抗炎效果
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.62
【目录】：
- 致谢6-7
- 摘要7-10
- Abstract10-17
- 缩略词17-20
- 第一章 绪论20-44
- 1.1 贻贝资源概述及研究进展20-32
- 1.1.1 国内贻贝资源概况20
- 1.1.2 贻贝软体部分的营养成分及价值20-23
- 1.1.3 贻贝生物活性物研究进展23-29
- 1.1.4 贻贝活性物的提取分离方法研究进展29-32
- 1.2 肠道屏障保护机理与肠道损伤表现32-34
- 1.2.1 肠道机械屏障32
- 1.2.2 肠道生物屏障32-33
- 1.2.3 肠道免疫屏障33
- 1.2.4 肠道损伤的表现33-34
- 1.3 贻贝脂质提取物与溃疡性结肠炎34-40
- 1.3.1 溃疡性结肠炎概述34
- 1.3.2 胞因子与溃疡性结肠炎34-36
- 1.3.3 TLR4/NF-κB通路与溃疡性结肠炎36-38
- 1.3.4 传统抗炎药物与溃疡性结肠炎的治疗38-40
- 1.3.5 贻贝脂质提取物与溃疡性结肠炎的治疗40
- 1.4 贻贝脂质提取物与类风湿性关节炎40-42
- 1.4.1 类风湿性关节炎概述40-41
- 1.4.2 贻贝脂质提取物与类风湿性关节炎的治疗41-42
- 1.5 本课题的研究背景、研究目的和研究内容42-44
- 1.5.1 研究背景42
- 1.5.2 研究目的及意义42
- 1.5.3 研究内容42-44
- 第二章 贻贝脂质提取物在小鼠巨噬细胞炎症模型中的抗炎活性探索44-63
- 2.1 引言44
- 2.2 试验材料与仪器44-46
- 2.2.1 主要材料44-45
- 2.2.2 主要试剂45-46
- 2.2.3 主要仪器设备46
- 2.3 试验方法46-55
- 2.3.1 主要试剂配制46-47
- 2.3.2 RAW264.7小鼠巨噬细胞的培养47
- 2.3.3 HMLE的细胞毒性评价47-49
- 2.3.4 HMLE对RAW264.7细胞NO释放量的影响49
- 2.3.5 HMLE对RAW264.7细胞炎症因子分泌量或炎症介质生成量的影响49-50
- 2.3.6 HMLE对RAW264.7细胞中TLR4/NF-κB信号通路关键基因以及iNOS基因表达的影响50-53
- 2.3.7 HMLE对RAW264.7细胞NF-κB激活的影响53-54
- 2.3.8 数据处理54-55
- 2.4 结果与分析55-61
- 2.4.1 HMLE的细胞毒性评价55-57
- 2.4.2 HMLE对RAW264.7细胞炎症因子分泌量及炎症介质生成量的影响57
- 2.4.3 HMLE对RAW264.7巨噬细胞NO释放量以及iNOS基因表达的影响57-60
- 2.4.4 HMLE对RAW264.7细胞TLR4/NF-κB信号通路中关键基因表达及关键信号分子激活的影响60-61
- 2.5 讨论与小结61-63
- 第三章 贻贝脂质提取物在小鼠肠道损伤模型中对肠道屏障的影响及其机理研究63-92
- 3.1 引言63
- 3.2 试验材料与仪器63-66
- 3.2.1 主要材料63-64
- 3.2.2 主要试剂64
- 3.2.3 主要仪器设备64-66
- 3.3 试验方法与设计66-74
- 3.3.1 HMLE油脂的配置与剂量选取66
- 3.3.2 小鼠分组与试验设计66-67
- 3.3.3 样品的采集与预处理67-68
- 3.3.4 红细胞磷脂脂肪酸检测68-69
- 3.3.5 组织切片的制备及分析69-71
- 3.3.6 生化指标的测定71-72
- 3.3.7 血清及结肠组织中炎症因子的含量测定72
- 3.3.8 结肠组织中炎症因子及TLR4/NF-κB通路关键信号分子基因表达的检测72-73
- 3.3.9 结肠组织中TLR4/MAPK/NF-κB通路关键信号分子蛋白表达的检测73-74
- 3.3.10 数据处理74
- 3.4 结果与分析74-88
- 3.4.1 HMLE对小鼠体重变化的影响74
- 3.4.2 HMLE干预对小鼠红细胞磷脂脂肪酸的影响74-76
- 3.4.3 HMLE对小鼠肠道机械屏障的保护作用评价76-81
- 3.4.4 HMLE对小鼠血清及结肠组织中免疫平衡的调控81-86
- 3.4.5 HMLE对小鼠结肠组织中TLR4/NF-κB信号通路中关键分子mRNA表达的调控86-87
- 3.4.6 HMLE对小鼠结肠组织中MAPKs及NF-κB信号通路关键分子蛋白活化的调控87-88
- 3.5 讨论与小结88-92
- 第四章 贻贝脂质提取物在小鼠溃疡性结肠炎模型中对病情的影响及其机理研究92-120
- 4.1 引言92
- 4.2 试验材料与仪器92-93
- 4.2.1 主要材料92-93
- 4.2.2 主要试剂93
- 4.2.3 主要仪器设备93
- 4.3 试验方法与设计93-99
- 4.3.1 HMLE油脂的配置与剂量选取93
- 4.3.2 小鼠分组与试验设计93-94
- 4.3.3 疾病活动指数(DAI)评分94-96
- 4.3.4 样品的采集与预处理96
- 4.3.5 组织切片的制备及分析96-97
- 4.3.6 生化指标的测定97-99
- 4.3.7 血清及结肠组织中炎症因子的含量测定99
- 4.3.8 结肠组织中炎症因子及TLR4/NF-κB通路关键信号分子基因表达的检测99
- 4.3.9 结肠组织中TLR4/MAPK/NF-κB通路关键信号分子蛋白表达的检测99
- 4.3.10 数据处理99
- 4.4 结果与分析99-115
- 4.4.1 不同干预处理对小鼠造模后生存率、体重及疾病活动指数(DAI)的影响99-102
- 4.4.2 小鼠结肠组织病理观察结果102-106
- 4.4.3 不同干预处理对小鼠肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数变化的影响106-107
- 4.4.4 不同干预处理对小鼠结肠组织氧化应激水平及髓过氧化物酶(MPO)活性的影响107-108
- 4.4.5 不同干预处理对小鼠结肠组织一氧化氮(NO)释放及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达的影响108-109
- 4.4.6 不同干预处理对小鼠免疫平衡的影响109-113
- 4.4.7 不同干预处理对结肠炎小鼠结肠组织中TLR4/MAPKs/NF-κB信号通路中关键分子mRNA及蛋白表达的调控113-115
- 4.5 讨论与小结115-120
- 第五章 贻贝脂质提取物对类风湿性关节炎患者临床症状改善作用的评价120-138
- 5.1 引言120
- 5.2 试验材料与仪器120-121
- 5.2.1 主要材料120
- 5.2.2 主要试剂120
- 5.2.3 主要仪器设备120-121
- 5.3 试验设计与方法121-125
- 5.3.1 筛选标准及样本量确定121
- 5.3.2 试验分组设计121-122
- 5.3.3 实验室指标测定与临床评价方法122-125
- 5.3.4 意向性分析(ITT analysis)和符合方案集分析(PP analysis)125
- 5.3.5 数据处理125
- 5.4 结果与分析125-135
- 5.4.1 受试者完成情况及基本数据125
- 5.4.2 试食期间的不良反应评价125-127
- 5.4.3 试食期间膳食营养素与能量摄入变化127
- 5.4.4 基于DAS28评分的疾病活动度改善127
- 5.4.5 基于CDAI评分的临床疾病指数改善127-130
- 5.4.6 其他临床疗效指标的变化130-133
- 5.4.7 HMLE试食对于血液脂肪酸组成及炎症因子变化的影响133-135
- 5.5 讨论与小结135-138
- 第六章 结论、创新点和研究展望138-140
- 6.1 结论138
- 6.2 创新点138-139
- 6.3 研究展望139-140
- 参考文献140-152
- 作者简介及在读期间所取得的科研成果152-
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