miRNA-34a靶向ACSL1对肝纤维化发生发展的机制研究

发布时间：2017-10-23 09:00

  本文关键词：miRNA-34a靶向ACSL1对肝纤维化发生发展的机制研究

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【摘要】：研究背景肝细胞肝癌是较常见的恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤中,其发病率排名第五,死亡率排名第三。肝纤维化是肝组织在各类慢性肝损伤性疾病发展过程中出现的过度组织修复,是各类慢性肝病进展为恶性结局的必经之路。肝纤维化具有双向病程:如果被早期诊断和治疗,病情可以逆转;如果得不到有效诊治,则可以进一步发展为预后极差的不可逆的肝硬化、肝癌。肝纤维化的发病机制复杂,虽然不同的病因有不同的病理生理过程,但肝星状细胞(hepatic stellated cell,HSC)的激活引起表型改变导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积是其发生发展病程中一个重要的共同通道。miRNA是一类在真核生物体内存在的不具备编码功能的小分子RNA,仅含有20~25个核苷酸。miRNA高度保守,常以家族形式存在,具有组织特异性和时序性。它们与靶基因的3’非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)以完全互补或不完全互补的形式特异性装载进入RNA诱导沉默复合体,引导m RNA降解或者阻止m RNA翻译,参与细胞的生长、增殖、分化和凋亡等。近些年研究发现:多种miRNA能够通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)通道、TGF-β/smad凋亡通道、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)和脂质代谢等多个信号通道调控肝纤维化病程中HSC的活化和增殖能力,参与肝纤维化的病理生理过程。在前期预实验研究中,我们使用二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导了SD大鼠的肝纤维化动物模型,应用miRNA的基因组高通量表达芯片发现:miR-34a表达显著增高,进一步通过实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,q RT-PCR)技术验证发现miR-34a的表达随着造模周期的延长而显著增加,因此miR-34a可能在肝纤维化进程中起重要作用。本研究拟通过探索miR-34a在临床肝纤维化病程及原代HSC自然活化增殖过程中的生物学特性,应用分子生物学方法分析并验证miR-34a的靶基因,进而研讨miR-34a通过靶基因在肝纤维化病程中的调控机制,为肝纤维化的早期诊断和治疗提供一个新的分子靶点。第一部分:miR-34a在肝纤维化进程中的表达及功能研究研究目的:检测不同分期临床肝纤维化组织标本和原代HSC自然活化增殖过程中miR-34a表达,分析miR-34a与肝纤维化进程和HSC活化程度的相关性。研究方法:1、收集临床肝纤维化组织标本,应用HE染色、Masson染色和Van Gieson(VG)染色对临床肝纤维化组织进行分期,q RT-PCR检测miR-34a在临床不同分期肝纤维化组织中的表达差异。2、Friedman二步分离法提取大鼠原代HSC并进行体外培养,台盼蓝染色法、自发荧光实验及免疫双荧光实验鉴定细胞活性、细胞纯度及细胞状态,q RT-PCR检测原代HSC体外培养到第2 d、第7 d和第14 d时miR-34a的表达水平。研究结果:1、依据METAVIR肝纤维化分期标准,应用HE染色、Masson染色和VG染色将临床肝纤维化组织分为F0期、F1期、F2期、F3期、F4期。q RT-PCR检测发现:与F0期肝组织相比,F1期、F2期、F3期、F4期肝纤维化组织中miR-34a的基因量表达分别增加6.2倍、21.3倍、32.4倍、39.8倍,P0.05。2、应用Fridman二步法提取大鼠原代HSC,通过台盼蓝染色法、自发荧光实验鉴定原代HSC细胞纯度95%,细胞存活率95%;应用免疫双荧光实验鉴定证实体外培养到第2 d的HSC为静止态,体外培养到第14 d的HSC为活化态。q RT-PCR检测发现:与体外培养2 d的HSC(静止态)相比,体外培养到第7 d(半活化态)的HSC中miR-34a表达量增加48.6倍,P0.05,体外培养到第14 d的HSC(活化态)中miR-34a的表达量增加192.0倍,P0.05。结论:1、miR-34a的基因表达量随着临床肝纤维化进程逐渐增加,与肝纤维化病程正相关。2、miR-34a的基因表达量随着原代HSC的自然活化增殖逐渐增加,与HSC的活化程度正相关。酶1(Acyl-Co A synthetase long-chain 1,Acsl1),验证miR-34a与Acsl1的靶向关系,研究Acsl1在临床各期肝纤维化组织和原代HSC自然活化增殖过程中的基因和蛋白表达水平。研究方法:1、以rno-miR-34a-5p为检索词,在micro RNA.org、Pic Tar、Target Scan、miRDB及miRbase 5个数据库进行靶基因预测,然后在Gene Ontology数据库进行靶基因的功能显著性(gene ontology,GO)分析,KEGG数据库进行代谢通道的pathway分析,结合本课题组前期预实验利用动物肝纤维化组织所获取的miRNA-m RNA表达谱,构建miRNA-Gene-Network,筛选出miR-34a-5p的靶基因。2、应用p MIR-REPORT载体构建Acsl1野生型(wild type,WT)和突变型(mutation,MUT)质粒,双荧光素酶报告基因系统验证miR-34a与Acsl1的靶向关系。3、应用q RT-PCR、Western Blot和免疫组化检测ACSL1在临床不同分期肝纤维化组织以及原代HSC自然活化增殖过程中的表达差异,分析其与miR-34a表达的相关性。研究结果:1、以rno-miR-34a-5p为检索词,在micro RNA.org、Pic Tar、Target Scan、miRDB及miRbase 5个数据库进行靶基因预测,取每个数据库前50的预测结果的交集为可能的靶基因。然后在Gene Ontology数据库进行靶基因的GO分析,KEGG数据库进行代谢通道的pathway分析。结合本课题组预实验利用动物肝纤维化组织得到的miRNA-m RNA表达谱,构建出miRNA-Gene-Network,发现Acsl1位于该网络的调控中心,受miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-19a、miR181a等5个miRNA的共同调控,因此Acsl1可能为rno-miR-34a的靶基因。2、通过生物信息技术分析,我们预测miR-34a-5p位点上有7个核糖核苷酸与Acsl1 3’-UTR的161-167位点互补,PCR扩增3’-UTR(Acsl1)序列构建于载体luciferase下游的Mlu I和Hind III,构建出Acsl1 WT质粒(p MIR-REPORT Acsl1 WT3’UTR)。再利用点突变技术将结合位点进行突变,构建入p MIR-REPORT luciferase载体的萤光素酶报告基因下游,构建出Acsl1 MUT质粒(p MIR-REPORT Acsl1 MUT3’UTR)。与共转染Acsl1 WT质粒和NC序列的293T工具细胞相比,共转染Acsl1 WT质粒和miR-34a inhibitor的工具细胞的Firefly luciferase/Renialla luciferase比值明显上升,P0.05,说明miR-34a对Acsl1有直接负向调控作用。与共转染Acsl1 MUT质粒和NC序列的工具细胞相比,共转染Acsl1 MUT质粒和miR-34a inhibitor后,第二部分:miR-34a靶基因的筛选与验证研究目的:应用生物信息学技术分析和筛选出miR-34a靶基因长链脂酰辅酶A合成其Firefly luciferase/Renialla luciferase比值无明显差异,P0.05,该结果说明当Acsl13’端161-167位点发生点突变后,miR-34a不能与之特异结合,对其负向调控作用消失。Acsl1是rno-miR-34a-5p的直接作用靶点。3、q RT-PCR检测结果显示:F1期、F2期、F3期、F4期临床肝纤维化组织中ACSL1的m RNA表达量分别为F0期肝组织的72.2%、44.4%、32.0%、22.2%,P0.05。相关性分析结果显示:ACSL1在肝纤维化组织中m RNA表达量与miR-34a负相关,R2=0.8221,P0.05。Western Blot检测和免疫组织化学检测结果显示:从F0期到F4期,ACSL1的蛋白表达量逐步减少。4、q RT-PCR检测结果显示:与体外培养到第2 d的静止态HSC相比,体外培养到第7 d、第14 d时,Acsl1的m RNA表达量分别下降22.3%、55.4%,P0.05。相关性分析结果显示:Acsl1在HSC中的表达量与miR-34a负相关,R2=0.9612,P0.05。Western Blot检测结果显示,体外培养到第2 d、第7 d、第14 d的Acsl1的蛋白表达量逐步减少。结论:1、Acsl1为miR-34a的靶基因。2、随着临床肝纤维化进展,ACSL1的基因和蛋白表达水平明显降低,ACSL1的m RNA表达量与miR-34a表达呈负相关。3、随着HSC的活化,Acsl1的m RNA和蛋白表达水平逐步下降,HSC细胞中Acsl1的m RNA表达量与miR-34a表达呈负相关。第三部分:miR-34a靶向Acsl1参与HSC活化增殖的相关研究研究目的:验证miR-34a靶向Acsl1对HSC活化增殖的生物学行为作用。研究方法:1、以a HSC为研究对象,将miR-34a inhibitor转染进入细胞中,检测Acsl1和肝纤维化指标I型胶原(Type I collagen,Col I)和α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的m RNA和蛋白表达水平。2、利用a HSC构建Acsl1干扰稳定细胞株,检测肝纤维化相关指标的m RNA和蛋白表达水平,判断Acsl1对肝纤维化进程的影响。3、回复实验(rescue assay)进一步验证miR-34a靶向Acsl1对HSC表型的调控。研究结果:1、q RT-PCR检测体外培养到第2 d(静止态)和体外培养到第14 d(活化态)的HSC中肝纤维化指标Col I和α-SMA的表达。结果显示:与体外培养到第2 d的HSC相比,体外培养到第14 d的HSC中Col I的表达增加8.7倍,α-SMA的表达增加2.7倍,P0.05。Western Blot结果显示:与体外培养到第2 d的HSC相比,Col I和α-SMA的蛋白表达亦出现显著增加。2、将miR-34a inhibitor转染进入a HSC,q RT-PCR和Western Blot检测Acsl1和肝纤维化指标(Col I和α-SMA)的m RNA和蛋白表达水平。q RT-PCR结果显示:与NC组比较,a HSC转染miR-34a inhibitor后Acsl1的m RNA表达量增加1.7倍,P0.05,Col I和α-SMA的m RNA表达量分别减少41.8%和63.5%,P0.05;而blank组与NC组相比,Acsl1、Col I和α-SMA的m RNA表达量无显著差异,P0.05。Western Blot结果显示:inhibitor组中Acsl1的蛋白表达量较NC组显著增加,Col I和α-SMA的蛋白表达量显著下降,而NC组和blank组中Acsl1、Col I和α-SMA蛋白表达差异不显著。3、构建带有EGFP荧光和嘌呤霉素抗性基因标记的大鼠Acsl1干扰慢病毒载体,通过菌落PCR鉴定阳性克隆及阳性克隆测序结果证实Acsl1干扰慢病毒载体构建成功。将Acsl1干扰慢病毒载体转入a HSC培育Acsl1干扰稳定细胞株Y2313、Y2314、Y2315,q RT-PCR检测三个干扰细胞株中Acsl1的干扰效率。实验结果显示:与干扰对照株比较,Y2313中Acsl1的m RNA表达量减少61%,P0.05;Y2314中Acsl1的m RNA表达量减少57%,P0.05;Y2315中Acsl1的m RNA表达量减少34%,P0.05;而干扰对照细胞株和a HSC中Acsl1的m RNA表达量比较,P0.05。该结果说明,Y2313的干扰效率最高,选为下一步实验过程中的Acsl1干扰稳定细胞株。q RT-PCR检测Acsl1干扰稳定细胞株中肝纤维化相关指标(Col I和α-SMA)的m RNA表达水平。结果显示:与干扰对照株比较,Acsl1干扰稳定细胞株中Col I和α-SMA的m RNA表达量分别增加3.3倍和1.4倍,P0.05,而干扰对照细胞株与a HSC中Col I、α-SMA的m RNA表达量比较无显著差异,P0.05。Western Blot结果显示:Acsl1干扰稳定细胞株中Col I和α-SMA的蛋白表达量较干扰对照细胞株显著增高,而干扰对照细胞株和a HSC中Col I和α-SMA的蛋白表达差异不显著。4、回复实验进一步验证miR-34a靶向Acsl1对HSC表型的调控。Acsl1干扰稳定细胞株和干扰对照细胞株分别转染miRNA NC和miR-34a inhibitor,观察肝纤维化相关指标(Col I和α-SMA)的表达。q RT-PCR结果显示:Acsl1干扰稳定细胞株分别转染NC和miR-34a inhibitor后,两组Col I和α-SMA的m RNA表达量无显著差异,P0.05;而与转染NC序列的干扰对照细胞株相比,转染miR-34a inhibitor的干扰对照细胞株中Col I的m RNA表达量下降了25.1%,P0.05,α-SMA的m RNA表达量下降了43.9%,P0.05。Western Blot检测各组的蛋白表达显示:Acsl1干扰稳定细胞株分别转染NC和miR-34a inhibitor后,两组Col1和α-SMA的蛋白表达无显著差异;与转染NC序列的干扰对照细胞株相比,转染miR-34a inhibitor的干扰对照细胞株中Col I和α-SMA的蛋白表达均出现显著下降。结论:1、随着HSC的活化,肝纤维化相关指标Col I和α-SMA的m RNA和蛋白表达水平均显著增加。2、miR-34a促进HSC活化,miR-34a功能抑制后可抑制HSC活化。3、Acsl1抑制HSC活化,Acsl1基因沉默可促进HSC活化。4、miR-34a通过靶向Acsl1在HSC表型调控中发挥其促肝纤维化功能,参与肝纤维化进程。
【关键词】：miR-34a 肝纤维化 HSC miR-34a ACSL1 靶基因 肝纤维化 HSC miR-34a ACSL1 HSC表型 肝纤维化指标
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 摘要5-11
• Abstract11-16
• 缩略词表16-17
• 前言17-19
• 第一部分 miR-34a在肝纤维化进程中的表达及功能研究19-39
• 材料与方法19-30
• 实验结果30-35
• 讨论35-39
• 第二部分 miR-34a靶基因的筛选与验证39-64
• 材料与方法39-50
• 实验结果50-61
• 讨论61-64
• 第三部分 miR-34a靶向Acsl1参与HSC活化增殖的相关研究64-84
• 材料与方法64-69
• 实验结果69-80
• 讨论80-84
• 全文总结84-85
• 参考文献85-93
• 综述93-119
• 参考文献102-119
• 研究生期间发表论文和参加科研工作情况119-121
• 致谢121-122

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Wen-Ce Zhou;Quan-Bao Zhang;Liang Qiao;;Pathogenesis of liver cirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

2 Catherine M Greene;Robert B Varley;Matthew W Lawless;;MicroRNAs and liver cancer associated with iron overload:Therapeutic targets unravelled[J];World Journal of Gastroenterology;2013年32期

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本文编号：1082530