根皮素和根皮素异烟酰基腙防治急性肝损伤活性及诱导人肝癌细胞凋亡机理研究

发布时间：2017-10-27 12:37

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【摘要】：急性肝损伤是一种极其常见的肝脏疾病,目前有效的临床预防和治疗方法是口服抗氧化剂和合理的药物支持治疗。急性肝损伤诱导因素主要有自由基、病毒、酒精、药物和免疫等原因,而自由基氧化损伤通常是急性肝损伤的一种主要病因。研究表明人体内活性氧(ROS)和自由基含量太高,容易引起肝细胞膜破坏和DNA损伤,进而导致急性肝损伤。因而,广泛筛选安全有效的高活性抗氧化剂,研究其生物效应和作用机制,进而指导临床合理用药,具有重要的科学意义和应用前景。根皮素是具有二氢查尔酮类结构的黄酮类化合物,存在于苹果、梨等果皮及根皮中以及多种蔬菜汁液中。已有研究表明,根皮素具有很好的抗氧化、抑制酪氨酸酶和抗癌活性等生物活性。具体如根皮素可抗氧化,淡化色斑,使皮肤增白,其效果优于曲酸和熊果苷等,是目前化妆品中常用的美白剂;同时,根皮素还具有抗肿瘤、降血糖、保护血管等活性。但是,由于根皮素在自然状态下很容易氧化变质,这极大地限制了它的应用范围和活性发挥。对其适度修饰,希望在增加其稳定性同时,能保存或提高其抗氧化和抑制酪氨酸酶活性能力,无疑是一项很有意义的工作。根皮素异烟酰基腙的合成和相关活性研究便是基于这一思路进行的。目前有关根皮素抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的研究较多,但研究根皮素及其化学修饰物根皮素异烟酰基腙预防和治疗急性肝损伤和抗癌作用机制的工作未见报道,基于此,本论文从这一方面展开了相关研究。基于本实验室的前期工作积累,本论文以槲皮素为参照物,研究了根皮素、根皮素异烟酰基腙(本实验室合成和结构表征)的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性;分别采用常用的D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺和对乙酰氨基苯酚造模,研究了根皮素和根皮素异烟酰基腙对小鼠急性肝损伤的保护作用。采用MTT法、流式细胞仪测定法、凝胶电泳法、蛋白印迹杂交和实时荧光定量PCR法,初步探索了根皮素和根皮素异烟酰基腙调控人肝癌BEL-7402细胞增殖和凋亡作用机制。研究结果表明,就采用的抗氧化模型而言,根皮素和根皮素异烟酰基腙均具有良好的抗氧化活性,而且根皮素异烟酰基腙活性明显优于根皮素,甚至优于阳性对照物槲皮素。而对于抑制酪氨酸酶二酚酶活性实验而言,根皮素活性优于根皮素异烟酰基腙。就研究的肝损伤模型而言,根皮素异烟酰基腙抗氧化肝损伤活性明显优于根皮素,甚至优于阳性对照物槲皮素。关于调控人肝癌bel-7402细胞增殖和凋亡作用机制实验,结果表明,根皮素和根皮素异烟酰基腙对bel-7402细胞具有细胞毒性和诱导细胞凋亡作用。诱导bel-7402细胞凋亡的途径,主要包括p53信号通路,bcl-2家族线粒体信号通路和由htert控制的端粒稳定性。综上所述,根皮素和根皮素异烟酰基腙是良好的抗氧化剂和酪氨酸酶二酚酶活性抑制剂,具有防治急性肝损伤的活性,对人肝癌bel-7402细胞具有细胞毒性和诱导细胞凋亡作用,是值得进一步研究的防治急性肝损伤的新型候选药物。第一章:绪论首先介绍了根皮素,酰腙化合物和酪氨酸酶的研究现状。然后介绍了急性肝损伤的病因、损伤机理,天然药物抗急性肝损伤的研究进展。再介绍了人肝癌凋亡机理研究进展,主要包括目前研究较多的各种信号转导通路和中药黄酮类化合物诱导细胞凋亡的研究进展。第二章:研究了槲皮素、根皮素、根皮素异烟酰基腙、水飞蓟宾抗氧化活性。研究方法包括清除dpph自由基、清除abts自由基,抑制体外肝脏线粒体脂质过氧化活性,和抗氧化保护超螺旋pbr322质粒dna。研究结果表明,根皮素异烟酰基腙、槲皮素、根皮素、水飞蓟宾具有明显的清除自由基和抑制脂质过氧化活性,呈浓度依赖性效应,活性顺序依次为根皮素异烟酰基腙槲皮素根皮素水飞蓟宾。根皮素异烟酰基腙的体系终浓度ic50分别为2.5μmol/l、2.27μmol/l、2.08μmol/l。槲皮素的体系终浓度ic50分别为4.0μmol/l、3.64μmol/l、6.67μmol/l。根皮素的体系终浓度ic50分别为10.0μmol/l、4.54μmol/l、12.50μmol/l。水飞蓟宾的体系终浓度ic50分别为125.0μmol/l、7.10μmol/l、104.16μmol/l。研究表明,根皮素异烟酰基腙、槲皮素和根皮素可以减少aaph诱导的超螺旋pbr322质粒dna破坏程度,而且呈现明显的剂量效应。抑制活性的排列顺序为根皮素异烟酰基腙槲皮素根皮素。总之,研究结果表明,就采用的抗氧化模型而言,根皮素和根皮素异烟酰基腙均具有良好的抗氧化活性,其中根皮素异烟酰基腙活性优于根皮素,甚至优于阳性对照物槲皮素。第三章:研究了根皮素和根皮素异烟酰基腙抑制酪氨酸酶活性。以l-dopa为底物测定槲皮素、根皮素、根皮素异烟酰基腙抑制酪氨酸酶二酚酶活性的ic50值,抑制的类型,并测定相应的抑制常数kI和kIS。试验结果显示,槲皮素、根皮素、根皮素异烟酰基腙抑制酪氨酸酶二酚酶活力的ic50值分别为25μmol/l,37.5μmol/l和50μmol/L(n=5,P0.05)。活性顺序为槲皮素根皮素根皮素异烟酰基腙。根皮素和根皮素异烟酰基腙对酶活力的抑制作用表现为可逆抑制作用,而且为混合型可逆抑制,根皮素KI为23.5μmol/L,KIS为129.0μmol/L,根皮素异烟酰基腙KI为57.5μmol/L,KIS为187.1μmol/L。研究结果表明,根皮素和根皮素异烟酰基腙具有很好的抑制酪氨酸酶二酚酶活性,是混合型可逆抑制,而且根皮素活性优于根皮素异烟酰基腙。第四章:研究了槲皮素、根皮素和根皮素异烟酰基腙对小鼠急性肝损伤的保护作用。本试验分别采用D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺和对乙酰氨基苯酚造模,诱导小鼠急性肝损伤,再研究槲皮素、根皮素和根皮素异烟酰基腙对小鼠急性肝损伤的保护作用,通过血清学(ALT、AST、γ-GT、ALP和血清总胆红素)、组织学方法,研究药物对肝脏的生化反应和组织病理变化的影响。试验结果表明,药物处理组小鼠血清ALT、AST、γ-GT、ALP和血清总胆红素明显降低(P0.05),而且降低幅度呈现剂量依赖性。活性顺序为根皮素异烟酰基腙槲皮素根皮素。预处理了根皮素、槲皮素和根皮素异烟酰基腙的小鼠肝组织病理学病变,得到了明显改善。研究结果表明,槲皮素、根皮素和根皮素异烟酰基腙对小鼠急性肝损伤有显著的保护作用,而且根皮素异烟酰基腙活性明显优于根皮素,甚至优于阳性对照物槲皮素。第五章:探索了根皮素和根皮素异烟酰基腙诱导人肝癌细胞凋亡的分子机理。本研究通过MTT法、流式细胞仪测定法、凝胶电泳法、蛋白印迹杂交和实时荧光定量PCR法,探索根皮素和根皮素异烟酰基腙诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制。总结机理,主要包括:抑制细胞增殖;作用于细胞周期的G0/G1期,阻滞细胞增殖,并促进细胞凋亡;降解基因组DNA;减少hTERT、p53和Bcl-2蛋白的表达量,增加Bax蛋白的表达量,减少hTERT基因的mRNA的表达量。结果表明,根皮素和根皮素异烟酰基腙对BEL-7402细胞能产生细胞毒性和诱导细胞凋亡。参与BEL-7402细胞凋亡的途径,包括内在和外在的凋亡途径,即p53的信号通路,Bcl-2家族线粒体信号通路和由hTERT控制的端粒稳定性。实验结果揭示了根皮素和根皮素异烟酰基腙诱导人肝癌细胞凋亡的部分分子机制,为根皮素和根皮素异烟酰基腙用作人类肝癌预防和化疗药物,奠定了实验基础。
【关键词】：根皮素 根皮素异烟酰基腙 抗氧化活性 抑制酪氨酸酶活性 急性肝损伤 D-氨基半乳糖 硫代乙酰胺 对乙酰氨基苯酚 凋亡机理 人肝癌细胞 蛋白印迹杂交 实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 缩写符号12-14
• 第一章 绪论14-37
• 1.1 根皮素研究概述14-15
• 1.2 酰腙类化合物研究概述15-16
• 1.3 酪氨酸酶研究概述16-17
• 1.4 急性肝损伤研究进展17-23
• 1.4.1 急性肝损伤的病因和损伤机理17-20
• 1.4.2 急性肝损伤的流行病学20
• 1.4.3 天然化合物抗急性肝损伤的研究进展20-23
• 1.5 人肝癌凋亡机理研究概述23-28
• 1.5.1 目前研究较多的各种肝癌信号转导通路23-27
• 1.5.2 人肝癌细胞凋亡机理研究常见的几种测定靶标27-28
• 1.6 课题来源28
• 1.7 主要研究内容和创新点28-29
• 1.8 参考文献29-37
• 第二章 根皮素和根皮素异烟酰基腙抗氧化活性研究37-51
• 2.1 引言37-38
• 2.2 材料与方法38-41
• 2.3 结果与讨论41-47
• 2.3.1 根皮素异烟酰基腙的表征41-42
• 2.3.2 清除DPPH自由基试验42-44
• 2.3.3 清除ABTS自由基试验44
• 2.3.4 抑制体外肝脏线粒体脂质过氧化试验44-45
• 2.3.5 抗氧化保护超螺旋pBR322质粒DNA试验45-47
• 2.4 结论47-48
• 2.5 参考文献48-51
• 第三章 根皮素和根皮素异烟酰基腙抑制酪氨酸酶活性研究51-59
• 3.1 引言51
• 3.2 材料与方法51-53
• 3.3 结果与讨论53-57
• 3.3.1 化合物对酪氨酸酶二酚酶活力的影响53
• 3.3.2 化合物对酪氨酸酶活力的抑制作用机理53-54
• 3.3.3 化合物抑制酪氨酸酶活性类型和抑制常数的测定54-57
• 3.4 结论57
• 3.5 参考文献57-59
• 第四章 根皮素和根皮素异烟酰基腙防治急性肝损伤研究59-77
• 4.1 引言59-60
• 4.2 材料与方法60-62
• 4.3 结果与讨论62-74
• 4.3.1 药物对ALT、AST活性的影响62-63
• 4.3.2 药物对 γ-GT和ALP活性的影响63-64
• 4.3.3 药物对血清总胆红素含量的影响64-65
• 4.3.4 组织病理学观察65-74
• 4.4 结论74-75
• 4.5 参考文献75-77
• 第五章 根皮素和根皮素异烟酰基腙诱导人肝癌细胞凋亡机理研究77-95
• 5.1 引言77
• 5.2 材料与方法77-81
• 5.3 结果与讨论81-90
• 5.3.1 MTT法测定药物处理对肝癌细胞增殖的影响81-82
• 5.3.2 流式细胞仪分析药物处理对细胞周期的影响82-84
• 5.3.3 流式细胞仪分析药物处理对荧光FITC标记的凋亡相关蛋白表达的影响84-85
• 5.3.4 凝胶电泳法检测药物处理对细胞的基因组DNA的影响85-87
• 5.3.5 检测药物处理组Bcl-2，，hTERT基因产物表达量和p53、Bax抑癌基因产物表达量变化87-89
• 5.3.6 检测药物处理对hTERT基因mRNA表达的影响89-90
• 5.4 结论90-92
• 5.5 参考文献92-95
• 攻读学位期间的研究成果95-96
• 致谢96

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本文编号：1103541