高迁移率族蛋白1在肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制研究

发布时间：2017-10-28 10:04

  本文关键词：高迁移率族蛋白1在肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制研究

  更多相关文章： HMGB1 胰岛素抵抗 炎症 肝脏 HMGB1 胰岛素抵抗 炎症 肝脏 自噬

【摘要】：第一章 HMGB1在高脂喂养小鼠肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制研究目的：研究高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)在高脂诱导肝脏胰岛素抵抗中的作用及其可能机制。方法：动物实验：1、C57/BL6雄性小鼠,分别高脂喂养0周、4周、8周、12周后,隔夜禁食12小时处死,留取各组小鼠的血清及肝脏组织。实验过程中,每4周测空腹血糖,干预第12周行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)及腹腔胰岛素耐量试验(IPITF)；2、使用ELISA试剂盒检测不同高脂喂养周数小鼠血清HMGB1水平；3、提取肝脏组织蛋白,运用West ern Blot、免疫组化的方法检测各组小鼠组织中HMGB1、胰岛素通路关键分子、NF-κB炎症通路蛋白表达水平。细胞实验：1、HepG2细胞不同时间梯度棕榈酸(PA)处理后检测胰岛素通路关键分子、培养基和细胞内HMGB1水平以及NF-κB炎症通路表达；2、检测不同浓度rhHMGB1干预后胰岛素通路以及炎症通路关键蛋白的表达水平结果：动物实验：1、随着高脂喂养周数的增加,小鼠空腹血糖较相应的普食对照组有逐步增加的趋势,并且在第12w开始有统计学意义(高脂12w组(7.83±0.51)mmol/L VS普食12W组±5.34±0.55)mmol/L,t=3.311,P=0.016);在高脂喂养第12W,IPGTT实验显示,注射葡萄糖30 min、60 min.120min时,高脂组血糖与普食组相比显著升高,且高脂组血糖曲线下面积(AUC)显著高于普食组(t=-7.295,P=0.002) ； IPITT实验显示,经过12W的高脂饮食处理,高脂组血糖曲线下面积明显增加(t=-10.216,p=0.001)；测定HFD-12W血清胰岛素水平发现相较与普食组出现明显的高胰岛素血症,HOMA-IR同样显著增加(t=-10.216, p=0.001)。2. ELISA检测不同高脂喂养时程血清HMGB1含量,结果显示随着高脂周数的增加,小鼠血清HMGB1含量呈现递增趋势,并且HFD-12W较HFD-OW组有明显上升(t=-3.085, p=0.037)；肝脏western blot结果示不同实验周数的小鼠肝脏HMGB1蛋白表达量也呈现逐渐增加的趋势,在第8W、12W较对照组有统计学意义(p0.05),肝脏HMGB1免疫组化同样验证以上结果。3、肝脏TLR4、RAG1蛋白表达量在实验的第八周以及八周之后出现较基线水平明显增加：分别提取肝脏细胞质和细胞核内的P65,结果示高脂8W、12W可明显增加P65入核数量和比例(p0.－5)。细胞实验：1、PA处理HepG2细胞20h、21h后p-AKT、水平较0h组下降,并有统计学意义；细胞培养基上清液检测HMGB1发现PA处理后HMGB1的浓度有一定的增加趋势,并且在20h.24h PA处理组明显增加(p0.05)；HMGB1蛋白表达量在PA处理第8h开始就有明显的增加趋势(p0.05)；肝脏TLR4表达量在PA处理第16h后出现有统计学意义的增加,RAGE蛋白的表达在PA处理第8h后即有统计学意义的提高,然而炎症通路关键分子P65的磷酸化激活明显增多出现在PA处理的第20h、2qh。2.100ng/ml、200ng/ml、 500ng/ml的rhHMGB1处理HepG2细胞24h后,p-IRS2(ser731)表达量明显增加(p0.05)。200ng/m l和500 ng/ml处理组的p-AKT表达量较CON组显著减少(p0.05)； 100 ng/ml、00ng/ml及500ng/ml的浓度作用24h后肝脏细胞内的炎症通路出现明显的活化(p0.05)。结论：HMGB1在肝脏胰岛素抵抗中可能扮演重要的始动因素,其可能通过结合胞外受体RAGE\TLR4激活NF-κB炎症通路进而发挥上述生物学功能。第二章细胞内HMGB1在PA诱导的胰岛素抵抗中的作用及其机制研究目的：研究细胞内HMGB1在PA诱导肝脏胰岛素抵抗中的作用及其可能机制。方法：1、慢病毒过表达HepG2细胞内HMGBA1后检测胰岛素通路关键分子、培养基和细胞内HMGBA1水平以及NF-κB炎症通路情况；2、使用小干扰技术下调细胞内HMGBl后,PA处理24h,提取nRNA、蛋白以及留收培养基上清,检测HMGB1.胰岛素通路变化；3、使用r11MGB1处理HepG2细胞内下调或不下调HMGB1 24h后,检测胰岛素通路的变化情况4.300umol/L PA处理下调HMGB1的HepG2细胞24h后,检测自噬活性的变化。结果：1. HMGB1过表达组与300uM PA处理组(PA组)有相似的蛋白表达水平(t=-1.363,p=0.245)。检测胰岛素通路关键分子IRS-2.AKT以及其磷酸化状况结果均提示：相较CON组,PA处理后引起的明显胰岛素抵抗,然而HMGBA1 OE组并未出现显著的变化。2、使用小干扰技术特异性下调HepG2细胞内HMGB1的表达后,300uM PA处理该组细胞24小时,可见胰岛素关键分子AKT、IRS2受损呈现加重趋势。与此同时,ELsA检测培养基上清HMGB1含量发现干扰组HMGB1含量较正常对照组并无明显变化。B、rhHMGB1干预结果提示：rHMGB1+siRNA-HMGB1处理组相较单纯rHMGB1组IRS2抑制性磷酸化位点ser731明显增加,AKT活性磷酸化明显下降。4、PA干预1lepG2 24小时后,自噬标志性指标LC38Ⅱ/LC3B Ⅰ显著下降,当下调HMGB1表达后相同方式处理24h,细胞自噬水平较PA组明显下降。RT-PCR方法检测自噬相关基因结果示：与PA组相比,atg3、atg4/atg7 mRNA水平均出现统计学意义的下降(p0.05)。结论：细胞内HMGB1在PA诱导的肝脏胰岛素抵抗中可能发挥保护作用,可能与细胞内HMGB1参与自噬调控有关。
【关键词】：HMGB1 胰岛素抵抗 炎症 肝脏 HMGB1 胰岛素抵抗 炎症 肝脏 自噬
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 第一章 HMGB1在高脂喂养小鼠肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制研究13-36
• 第一部分 前言13-14
• 第二部分 实验材料与方法14-24
• 第三部分 实验结果24-31
• 第四部分 讨论31-34
• 第五部分 参考文献34-36
• 第二章 细胞内HMGB1在PA诱导的胰岛素抵抗中的作用及其机制研究36-49
• 第一部分 前言36-37
• 第二部分 实验材料与方法37-41
• 第三部分 实验结果41-45
• 第四部分 讨论45-47
• 第五部分 参考文献47-49
• 结论49-50
• 第三章 文献综述50-56
• 参考文献54-56
• 附录56-57
• 致谢57-58

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本文编号：1107732