间隙性禁食对肝脏缺血再灌注的保护作用及其机制研究

发布时间：2017-10-29 13:26

  本文关键词：间隙性禁食对肝脏缺血再灌注的保护作用及其机制研究

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【摘要】：研究背景和目的：目前肝脏的缺血再灌注损伤依然是导致肝脏外科手术、创伤和和肝移植过程中高发病率和死亡率的重要原因之一。肝脏的缺血再灌注损伤是决定肝脏在经过肝叶切除或肝组织移植手术后肝组织活性最重要的决定因素。为了更加有效的减轻肝缺血再灌注损伤,有关肝缺血再灌注损伤的机制和治疗方法还需进行深入的研究。间隙性禁食和热量限制可以延长寿命,并且降低了年龄相关疾病的发展。间隙性禁食和热量限制可抑制氧化应激反应和炎症反应,并能降低肝外科手术和肝移植术后肝脏的损伤程度,对肝缺血再灌注损伤有重要的保护作用。短期间隙性禁食或许是以减少肝外科手术术后并发症的一个可行性策略。为了支持其临床转化,间隙性禁食对肝缺血再灌注损伤保护作用的需进一步阐明。因此我们利用小鼠的肝缺血再灌注损伤的模型,来研究间隙性禁食对肝脏的保护作用是否与肝脏的能量代谢、炎症反应或肠道菌群改变有关。研究方法：1.将间隙性禁食小鼠作为实验组小鼠,随意进食的同窝野生型小鼠作为对照组小鼠,建立肝缺血再灌注损伤模型。术后6h、12h和24h收取两组小鼠肝脏、血清和结肠粪便。2.利用血生化自动分析仪检测肝转氨酶、血糖、血甘油三酯、血胆固醇、游离脂肪酸的表达水平。3.用专用的商品化试剂盒检测血清肝β-羟基丁酸和肝组织中肝甘油三酯、肝糖原和肝β-羟基丁酸的含量。4.利用ELISA法检测血清炎性因子TNF-α, IL-1β, IL-6和IL-10的表达。5.用专用的商品化试剂盒检测还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H202)的表达水平和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性。6.用TUNEL法检测肝细胞的凋亡坏死。7.用western blot法检测肝组织中NF-KB, MAPKs信号通路蛋白、NLRP3炎性复合物蛋白及LPS/TLR4信号通路相关蛋白的表达。8.采用CTAB方法提取样本的基因组DNA,对16S rDNA高变区测序序列进行扩增,利用HiSeq PE250平台测序,测序为V3-V4区,进行肠道菌群物种的鉴定。结果：1.间隙性禁食可减轻了小鼠的体重。2.间歇性禁食对缺血再灌注损伤有重要的保护作用,降低了血清ALT、AST的水平。3.间歇性禁食引起了肝脏能量来源的改变,间隙性禁食组小鼠的血糖、血胆固醇、血甘油三酯下降,血清β-羟基丁酸和血游离脂肪酸(FFA)的浓度逐渐升高。间隙性禁食组小鼠的肝糖原和肝甘油三酯含量逐渐降低、脂肪酸β氧化活性增强,酮体(β-羟基丁酸)生成增加。4.间隙性禁食通过抑制肝缺血再灌注诱导的氧化应激反应来减轻肝脏的损伤。间隙性禁食(IF)组肝组。织的还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H202)的表达水平和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性和任意进食(AL)组相比较,差异有统计学意义。5.间隙性禁食抑制了肝脏缺血再灌注损伤中的炎性反应活性。血清促炎因子如TNF-α, IL-1β, IL-6的表达降低,血清抑制炎性的因子IL-10的表达升高。6.IF减少了NF-KB, MAPKs的表达和抑制了肝缺血再灌注损伤诱导的NLRP3炎性复合物的活性。7.间隙性禁食抑制了活性氧的活性,减少了肝缺血再灌注损伤中肝细胞的凋亡。8.间隙性禁食抑制肝缺血再灌注损伤中肝组织TLR4的表达。9.间隙性禁食促进了肝缺血再灌注损伤中肝组织SIRT3的表达。10.间隙性禁食抑制了肝缺血再灌注损伤中肝脏的再生。11.间隙性禁食引起了肠壁通透性和肠道菌群组成的改变,促进了肠壁上皮细胞紧密连接蛋白的表达,减少了菌群移位的发生。间隙性禁食可能通过减少了肠道菌群的移位和肠道格兰阴性菌的数量,减轻了肝缺血再灌注损伤。结论：1.间隙性禁食对肝脏的缺血再灌注损伤有重要的保护作用,减轻了肝组织的坏死。2.间隙性禁食引起了肝脏能量代谢的改变,肝脏糖原生成和糖异生作用增强,非酯化脂肪酸通过在肝脏线粒体的脂肪酸β氧化活性增高,生成大量酮体。将酮体作为肝组织和其它肝外器官的能量来源。3.间隙性禁食可以抑制氧化应激反应,通过抑制活性氧的产生,减少了肝细胞的凋亡和坏死。4.间隙性禁食通过抑制炎症反应,减轻了肝组织的损伤。通过抑制NF-κB and MAPKs信号通路和NLRP3炎性复合物的活性,减少细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18的产生。5.间隙性禁食引起肠壁通透性和肠道菌群组成的改变,间隙性禁食可能通过减少了肠道格兰阴性菌的数量和肠道菌群的移位,可能通过抑制LPS/TLR4通路的活性,减轻了肝脏的缺血再灌注损伤。
【关键词】：肝缺血再灌注损伤 间隙性禁食 炎症反应 肠道菌群
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 缩略词10-12
• 前言12-14
• 第一部分 小鼠间隙性禁食及肝缺血再灌注损伤模型的建立14-18
• 实验材料14-15
• 实验方法15-18
• 第二部分 间隙性禁食对肝缺血再灌注损伤的影响18-83
• 实验材料18-22
• 实验方法22-42
• 结果42-70
• 1. 间隙性禁食对小鼠体重的影响42
• 2. 间隙性禁食对肝功能的影响42-44
• 3. 间歇性禁食引起了肝脏能量来源的改变44-45
• 4. 间隙性禁食通过抑制肝缺血再灌注诱导的氧化应激反应来减轻肝脏的损伤45-46
• 5. 间隙性禁食抑制了肝脏缺血再灌注损伤中的炎性反应活性46-48
• 6. IF减少了NF-KB，MAPKs的表达和对肝缺血再灌注损伤诱导的化RP3炎性复合物活性的抑制作用48-50
• 7. 间隙性禁食抑制了肝缺血再灌注损伤中肝细胞的调亡50-53
• 8. 间隙性禁食对肝缺血再灌注损伤中TLR4表达的影响53
• 9. 间隙性禁食对肝缺血再灌注损伤中SIRT3表达的影响53-54
• 10. 间隙性禁食抑制了肝缺血再灌注损伤中肝脏的再生54
• 11. 间隙性禁食引起肝缺血再灌注过程中肠道菌群的影响54-55
• 12. 肠道菌群DNA的提取及测序过程55-70
• 讨论70-83
• 研究结果83-84
• 研究结论84-85
• 参考文献85-93
• 文献综述93-103
• 参考文献98-103
• 致谢103-105

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