以减毒沙门氏菌为载体的H5N1流感疫苗及乙肝基因治疗药物研究

发布时间：2017-10-31 11:22

  本文关键词：以减毒沙门氏菌为载体的H5N1流感疫苗及乙肝基因治疗药物研究

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【摘要】：由于减毒肠道细菌如沙门氏菌,具有通过口服并入侵宿主细胞的特性,减毒沙门氏菌作为核酸疫苗传递载体非常具有应用前景。在本研究中,我们构建了一株新型减毒沙门氏菌SL368,并将其作为载体传递和表达高致病性H5N1流感病毒的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,即沙门氏菌流感疫苗Sal-HA-NA。结果表明,我们构建的减毒沙门氏菌SL368表现出较高的基因传递效率以及对小鼠的低细胞毒性和低致病性。以BALB/c小鼠作为动物模型,我们研究了Sal-HA-NA的免疫效果。结果显示,通过口服免疫接种,Sal-HA-NA诱导小鼠产生了抗HA血清IgG、粘膜IgA以及分泌干扰素γ的T细胞。同时口服接种表达病毒HA和NA蛋白沙门氏菌流感疫苗的小鼠经过高致病性H5N1流感病毒以及H1N1流感病毒攻毒后全部存活下来,而口服接种携带空载质粒的沙门氏菌的小鼠全部死亡。这些结果表明Sal-HA-NA诱导机体产生了强烈的特异性体液和细胞免疫反应,并使机体获得了抵抗多种流感病毒的能力。此外,我们的研究还表明发展以减毒沙门氏菌为载体的新型口服疫苗抵抗流感病毒具有可行性。肝脏特异性的miR-122已被证实能够通过碱基配对的方式与乙肝病毒高度保守的前基因组RNA序列结合,进而抑制乙肝病毒基因的表达和复制。然而,在哺乳动物细胞中,miR-122的瞬间沉默效应和细胞毒性限制了其在治疗乙肝病毒感染方面的应用潜力。在本研究中,我们基于在细胞内指导合成siRNA样转录体的pSuper basic载体构建pSB-miR-122质粒,来持续表达miR-122延长抑制HBV基因表达的时间。同时用一种新型减毒沙门氏菌将pSB-miR-122质粒高效地带入肝脏细胞,大量表达miR-122,并且对小鼠无副作用。此外,口服接种表达miR-122沙门氏菌药物的小鼠体内乙肝病毒基因的表达受到了抑制。这些结果表明,表达miR-122的沙门氏菌药物介导的基因疗法可以抑制体内乙肝病毒基因的表达。
【关键词】：沙门氏菌 流感疫苗 miR-122 乙肝病毒
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392;R512.62
【目录】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 前言14-42
• 1.1 胞内菌作为活疫苗载体的研究概况14-26
• 1.1.1 减毒活疫苗载体在预防感染性疾病和治疗癌症中的应用14-17
• 1.1.2 沙门氏菌毒力与沙门氏菌免疫17-20
• 1.1.3 沙门氏菌作为载体传递异源抗原20-23
• 1.1.4 沙门氏菌作为活疫苗载体的应用23-25
• 1.1.5 沙门氏菌载体在抗肿瘤治疗中的应用25-26
• 1.2 流感病毒概述26-34
• 1.2.1 A型流感病毒的宿主范围27-28
• 1.2.2 A型流感病毒的进化28-30
• 1.2.3 A型流感病毒的致病机理30
• 1.2.4 流感病毒感染的社会影响和防治措施30-31
• 1.2.5 流感疫苗31-34
• 1.3 乙肝病毒概述34-40
• 1.3.1 乙肝病毒感染引起的疾病及药物治疗36-37
• 1.3.2 乙肝病毒感染的基因治疗37-38
• 1.3.3 基因疗法抵御乙肝病毒的作用机理38-40
• 1.4 研究目的与意义40-42
• 第二章 实验材料和实验方法42-61
• 2.1 生物材料42
• 2.2 实验设备和仪器42-43
• 2.3 实验材料和试剂43-44
• 2.3.1 分子生物学相关实验材料和试剂43
• 2.3.2 细胞生物学相关实验材料和试剂43-44
• 2.3.3 蛋白质分析相关实验材料和试剂44
• 2.3.4 病毒学与动物学相关实验材料和试剂44
• 2.4 分子克隆实验44-49
• 2.4.1 大肠杆菌DH5α化转感受态细胞的制备及使用44-45
• 2.4.2 Red重组法构建沙门氏菌缺失突变株SL368和SL30145-46
• 2.4.3 沙门氏菌电转感受态细胞的制备及使用46-47
• 2.4.4 质粒的提取47
• 2.4.5 抗生素的配制47-48
• 2.4.6 限制性酶切和PCR实验48-49
• 2.5 细胞水平相关实验49-52
• 2.5.1 细胞传代培养49-50
• 2.5.2 细胞转染(脂质体转染法)50-51
• 2.5.3 沙门氏菌感染细胞51
• 2.5.4 收获细胞51
• 2.5.5 RNA的提取51-52
• 2.6 蛋白质水平实验52-53
• 2.6.1 SDS-PAGE及Western-blot52-53
• 2.7 病毒学相关实验53-55
• 2.7.1 流感病毒的增殖53-54
• 2.7.2 流感病毒滴度测定54-55
• 2.7.3 流感病毒的保存55
• 2.8 动物学及免疫学相关实验55-61
• 2.8.1 动物的免疫及攻毒55-56
• 2.8.2 酶联免疫实验(ELISA)56-57
• 2.8.3 小鼠脾细胞分离57-58
• 2.8.4 酶联免疫斑点实验(ELISPOT)58-59
• 2.8.5 血凝抑制实验59
• 2.8.6 HE染色实验59-60
• 2.8.7 免疫组化实验60-61
• 第三章 以减毒沙门氏菌为载体的新型口服流感疫苗及其免疫效力的研究61-79
• 3.1 研究背景61-63
• 3.2 实验结果63-76
• 3.2.1 沙门氏菌口服流感疫苗Sal-HA-NA的构建63-66
• 3.2.2 Sal-HA-NA介导流感病毒抗原蛋白在细胞、小鼠体内传递和表达66-70
• 3.2.3 Sal-HA-NA能够诱导机体产生特异性体液免疫应答和黏膜免疫应答70-71
• 3.2.4 Sal-HA-NA能够有效增强小鼠特异性细胞免疫应答71-72
• 3.2.5 Sal-HA-NA能够提高小鼠针对H5N1亚型和H1N1亚型流感病毒感染的免疫保护72-76
• 3.3 讨论76-79
• 第四章 以减毒沙门氏菌为载体的新型乙肝治疗药物的研究79-89
• 4.1 研究背景79-80
• 4.2 实验结果80-86
• 4.2.1 miR-122在小鼠体内可有效抑制乙肝病毒基因的表达80-82
• 4.2.2 以减毒沙门氏菌为载体的乙肝治疗药物Sal-miR122的构建82-83
• 4.2.3 miR-122通过减毒沙门氏菌SL301介导在细胞内的传递和表达83-85
• 4.2.4 Sal-miR122能够有效抑制小鼠体内乙肝病毒基因的表达85-86
• 4.3 讨论86-89
• 研究总结89-90
• 参考文献90-108
• 缩略词表108-110
• 攻读博士期间的学术成果110-111
• 致谢111

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