Arkadia对肝纤维化SnoN蛋白降解作用的体内外实验研究

发布时间：2017-11-15 06:21

  本文关键词：Arkadia对肝纤维化SnoN蛋白降解作用的体内外实验研究

  更多相关文章： 肝纤维化 逆转 肝星状细胞 SnoN Arkadia 纤连蛋白FN

【摘要】：背景与目的:肝纤维化是多种慢性肝病发展成肝硬化及肝功能失代偿的共同阶段,但其发病机制至今尚未完全阐明,且总体疗效仍不理想。因此需要进一步深入探讨肝纤维化发生发展的分子机制,为寻找干预肝纤维化进展和逆转肝纤维化的有效靶点提供实验依据。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前公认促肝纤维化最有效、最有力的细胞因子,Smad信号是其发挥作用的主要通路。而Sno N蛋白能阻断TGF-β1/Smad信号,抑制肝纤维化。我们前期研究发现,不同肝纤维化动物模型及病人纤维化肝组织中,Sno N蛋白减少,而Sno N基因转录水平未改变,可能与泛素化降解Sno N蛋白的关键酶Arkadia有关,但其作用和机制尚不清楚。因而本研究从体内及体外两方面着手,探Arkadia降解Sno N的分子机制。本研究将有利于深入阐明肝纤维化发病机制。方法:(1)体内研究:大鼠适应性饲养(标准饲料,自由饮水)1周,采用随机数值表法进行分组,CCl4(carbon tetrachloride)肝纤维化模型组(model)43只,腹腔注射50%的CCl4橄榄油溶液0.15 ml/100 g体重,2次/周,共8周,8周后停止注射,继续饲养4周,建立肝纤维化逆转模型,大鼠分别于第2、4、6、8、10、12周处死;对照组7只大鼠腹腔注射等量生理盐水,于第8周一并处死,并留取肝脏标本,心脏取血,收集血清。大体标本观察、HE染色、Masson染色和血清生化检测确定大鼠肝纤维化模型是否成功,通过Western Blot技术检测Arkadia、Sno N、FN、TGF-β1、Collagen-Ⅰ、α-SMA等的表达。实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,q RT-PCR)检测Arkadia、FN的表达。免疫组织化学检测Arkadia、Sno N、FN的表达。(2)体外研究:用10 ng/ml的TGF-β1刺激肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC),分别在2、6、12、24及48小时(hour,h)收集细胞。用不同浓度(0ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)的TGF-β1刺激HSC细胞,12h后收集细胞。细胞免疫荧光法定位检测Arkadia、Sno N、FN的表达。Western blot及实时荧光定量PCR检测Arkadia、FN的表达。结果:大体标本观察、HE染色、Masson染色和血清生化检测结果提示CCl4导致的化学性肝纤维化大鼠模型及其逆转模型复制成功;纤维化肝组织中FN等m RNA表达上调;随纤维化病程进展FN、TGF-β1、Collagen-Ⅰ、α-SMA等表达增加。Sno N蛋白在肝纤维化组织中表达减少,Arkadia蛋白则表达增多。TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中,Arkadia及FN随着刺激浓度的升高及时间的延长,表达逐渐增多,并在浓度为10ng/ml及12h时,表达最多。结论:Arkadia蛋白在纤维化肝组织中表达增多,Sno N蛋白表达减少。肝纤维化在停止损伤因素后可发生逆转,且Arkadia及Sno N蛋白的表达也会发生相应变化。
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2

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本文编号：1188680