肠神经胶质细胞在溃疡性结肠炎炎症—肿瘤序列演进中的作用研究

发布时间：2017-11-17 21:26

  本文关键词：肠神经胶质细胞在溃疡性结肠炎炎症—肿瘤序列演进中的作用研究

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【摘要】：目的通过对AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型腹腔注射肠神经胶质细胞(EGC)培养上清液进行干预,以及将EGC与小鼠肠上皮细胞(IEC-6)共培养,从体内体外两方面探讨EGC在溃疡性结肠炎炎症-肿瘤序列演进中的作用及可能机制。方法1采用随机数字表法将180只SPF级雌性BALB/C小鼠随机分为4组,即:A实验组(EGC+DSS),B条件对照组(DMEM+DSS),C模型组(DSS)和D空白对照组(Control)。前三组给予AOM及2%DSS干预,构建结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型,定时观察记录各组小鼠的一般情况,并进行疾病活动指数(DAI)评分。实验组从第4周开始每天腹腔注射EGC培养上清液100uL干预。各组分别在实验第1、3、4、6、7、9、12、15及20周末采用随机数字表法随机抽取5只小鼠采集外周血后处死小鼠,收集肠组织标本。外周血离心后收集血清标本采用抗体芯片检测炎症细胞因子水平,ELISA法检测NGF、GDNF细胞因子水平;肠组织标本测量长度并进行结肠大体损伤程度(CMDI)评分,HE染色并进行组织损伤程度(HS)评分,观察从溃疡性结肠炎炎症-不典型增生-肿瘤演进过程中的病理变化并统计成瘤率和瘤体数目(≥2mm)。免疫组化法检测GFAP、S100β及PGP9.5等蛋白的表达,Western Blot法检测肠组织NF-κB、IKKβ、PI3K、AKT、PTEN及ZO-1等蛋白的表达。2利用Transwell小室共培养EGC和IEC-6细胞,在共培养系统加入TNF-a和IL-6细胞因子(30ug/ml)进行干预,通过荧光素渗漏实验检测EGC对IEC-6单层细胞屏障功能的影响,BrdU掺入法检测EGC对IEC-6细胞增殖的影响,流式细胞术检测EGC对IEC-6细胞周期及凋亡的影响,Western Blot法检测EGC对IEC-6细胞Caspase-3、Bcl-2、E-Cadherin及ZO-1等蛋白表达的影响。结果1体内实验结果:1)DAI评分:与正常对照组对比,模型组DAI评分1W(0.67±0.62 vs 0)、4W(0.80±0.73 vs 0)、7W(1.00±0.85 vs 0)、9W(0.67±0.47 vs 0.07±0.15)、12W(0.93±0.43 vs 0.20±0.18)、15W(1.13±0.18 vs 0.20±0.45)及20W(1.53±0.30 vs 0.07±0.15)均升高,差异有统计学意义(p0.05);实验组与条件对照组对比各时间点差异均无统计学意义。2)cmdi评分:与正常对照组对比,模型组cmdi评分1w(0.56±0.47vs0)、4w(2.37±1.57vs0)、7w(3.56±1.65vs0)、9w(2.86±0.99vs0)、12w(2.02±1.24vs0)、15w(3.26±1.13vs0)及20w(3.88±0.90vs0)均升高,差异有统计学意义(p0.05);实验组与条件对照组对比7w(1.32±1.38vs3.96±1.49,p0.01),20w(2.63±0.64vs3.83±0.80,p0.05)减低,其余各时间点差异均无统计学意义。3)hs评分:与正常对照组对比,模型组hs评分各时间点均升高,差异有统计学意义(p0.05);实验组与条件对照组对比4w(8.84±1.10vs10.66±1.25,p0.05),7w(10.32±1.58vs13.96±2.49,p0.05)减低,其余各时间点差异均无统计学意义。4)结直肠长度:与正常对照组对比,模型组除3w(8.82±0.95vs9.56±0.66,p0.05)外其余时间点结直肠长度均明显缩短,差异有统计学意义(p0.01)。实验组与条件对照组对比各时间点差异均无统计学意义。5)成瘤率及瘤体数目(≥2mm):实验组、条件对照组和模型组均从第6周末开始出现重度不典型增生及癌变,第6w成瘤率为50%,随时间延长逐渐升高,至第20w均达100%。第15w肿瘤数目(≥2mm)实验组vs条件对照组:3.17±1.72vs5.83±2.04,p0.05;第20w肿瘤数目(≥2mm)实验组vs条件对照组:2.67±1.37vs5.67±2.58,p0.05。其余时间点差异无统计学意义。6)抗体芯片结果显示:第4w开始实验组血清细胞因子timp-1(a/b由4w5.99倍降至20w0.00倍),m-csf(a/b由4w3.48倍降至20w0.42倍),g-csf(a/b由4w3.48倍降至20w0.39倍),il-6(a/b由4w2.60倍降至20w0.44倍)逐渐降低。而mip-1a(a/b由4w1.00倍升高至20w67.32倍),il-2(a/b由4w078倍升高至20w3.67倍),blc(a/b由4w1.30倍升高至20w2.95倍)逐渐升高。7)elisa法检测gdnf和ngf结果显示:实验组ngf在第4、9、15及20周较条件对照组升高(p0.05),gdnf从第6周开始较条件对照组均升高(p0.05)。8)免疫组化结果显示:模型组vs正常对照组6wgfap、s100β表达降低(p0.05),7wpgp9.5表达降低(p0.05),9wgfap表达降低(p0.05)。实验组与条件对照组对比20wgfap和s100β表达升高(p0.05),其余时间点差异无统计学意义。9)westernblot结果显示:4w和6w实验组vs条件对照组zo-1表达升高(p0.05)。其余时间点各组之间差异无统计学意义。PTEN-PI3K/AKT:4W-6W实验组PTEN表达升高,而PI3K和AKT表达降低;7W实验组PTEN表达升高,而PI3K和AKT表达均降低。15W实验组vs条件对照组PTEN表达升高(p0.01),而PI3K表达降低(p0.05)。IKKβ/NF-κB:实验组vs条件对照组6W IKKβ表达降低(p0.05),NF-κB表达无明显差异;7W NF-κB表达降低(p0.01),IKKβ表达降低(p0.01)。2体外实验结果1)荧光素渗漏试验结果:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6(724.33±22.08 vs1451.50±36.18,p0.01),IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a(1261.17±53.08vs 2623.50±62.77,p0.01)下室荧光素量均减少。2)BrdU掺入实验检测IEC-6细胞增殖:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6(0.168±0.075 vs 0.023±0.015,p0.05)IEC-6细胞增值率升高,其余各组之间差异无统计学意义。3)流式细胞术检测IEC-6细胞凋亡:EGC与IEC-6共培养,以及加入TNF-α和IL-6后共培养IEC-6细胞早期凋亡率均减低,差异有统计学意义(p0.01)。4)流式细胞术检测IEC-6细胞周期结果显示:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6 G0/G1期细胞数增加(p0.05)而S期细胞数减少(p0.01)。IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a S期细胞数减少(p0.05)而G0/G1期细胞数差异无统计学意义。5)Western Blot结果显示:IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6 ZO-1和E-cadherin表达升高(p0.01),而IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a ZO-1和E-cadherin表达差异无统计学意义。IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a Bcl-2表达升高(p0.05),而在共培养体系加入IL-6 Bcl-2表达无差异。结论1成功构建AOM/DSS诱导结肠炎相关性结直肠癌实验动物模型。2在结肠炎炎症-肿瘤序列演进过程中,EGC可降低血清炎症细胞因子水平,升高血清NGF、GDNF水平,其机制可能与其抑制IKKβ/NF-κB有关。此外,可能通过调控PTEN-PI3K/AKT途径抑制上皮细胞凋亡,增加ZO-1表达从而降低肠粘膜通透性,减缓炎症-不典型增生-癌变的进程。3体外研究结果显示EGC可以促进肠上皮细胞的增殖,抑制其凋亡,并且通过促进紧密连接蛋白ZO-1和E-cadherin的表达维护肠粘膜屏障的完整性。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574.62;R735.34

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