熊果酸对NADPH氧化酶亚基在静止型肝星状细胞活化过程中表达及功能的影响

发布时间：2017-11-21 14:09

  本文关键词：熊果酸对NADPH氧化酶亚基在静止型肝星状细胞活化过程中表达及功能的影响

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【摘要】：背景:肝纤维化由各种慢性肝损伤引起的肝脏过度修复反应造成,主要以I型胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝脏内过度沉积为特征。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是ECM的主要来源,所以静止型HSC向活化型HSC激活、转化的过程是肝纤维化的中心事件。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)及其产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)诱导的氧化应激被证实在HSC的激活、转化及肝纤维化发病及进展中具有十分重要的作用。我们前期研发现中药单体熊果酸能够显著抑制细胞因子瘦素、AngII及PDGF诱导的活化型HSCs内NOX亚基的表达、NOX活性、NOX来源的ROS产生及其NOX下游PI3K/Akt、p38MAPK信号通路的激活,从而抑制活化型HSCs的增殖、并诱导其凋亡,发挥抗肝纤维化作用。那么熊果酸干预是否也能够通过下调NOX的表达而抑制静止型HSC的活化,早期预防肝纤维化的发生,目前尚未阐明。本课题将继续在前期研究的基础上,以健康大鼠原代静止型肝星状细胞为研究对象,以TGF-β为促HSC活化因子,探讨熊果酸对静止型HSC活化过程中NOX亚基表达的影响及该影响与静止型HSC激活、转化之间的关系,进一步探讨熊果酸抗肝纤维化的作用机制。目的:探讨熊果酸对大鼠静止型HSC活化过程中NOX亚基表达的影响,及该影响与静止型HSC激活、转化之间的关系。方法:采用肝脏原位灌注及密度梯度离心法从健康SD大鼠体内分离提取原代静止型HSCs,待原代HSCs自然培养至第5天时将细胞随机分成五组并加用不同药物进行处理:空白对照组(control组,细胞自然培养活化),熊果酸组(UA组,40μM),TGF-β组(5μg/L),熊果酸干预组(UA+TGF-β组,UA 40μM+TGF-β5μg/L),DPI干预组(DPI+TGF-Β组,DPI 10μM+TGF-β5μg/L)。原代HSCs经加药处理24h后提取细胞总蛋白,Western blot检测NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox及HSC活化特异性标志物α-SMA的蛋白表达水平。药物作用12h后采用rt-qpcr检测nox亚基rac1、p22phox及i型胶原的mrna表达。结果:1熊果酸对静止型hsc活化过程中nox亚基蛋白表达的影响1.1熊果酸对静止型hsc活化过程中gp91phox蛋白表达的影响tgf-β刺激原代hscs24h后gp91phox蛋白水平明显高于空白对照组(p0.01);熊果酸组nox亚基gp91phox蛋白表达明显低于空白对照组(p0.05);在tgf-β刺激原代hscs之前加入熊果酸进行干预后gp91phox蛋白水平较单纯tgf-β刺激组显著降低(p0.01),并且与nox抑制剂dpi干预组相比gp91phox蛋白的表达无统计学差异(p0.05)。上述实验结果表明,静止型hsc活化过程中gp91phox蛋白表达明显升高,而熊果酸干预能够抑制静止型hsc活化过程中nox亚基gp91phox的蛋白表达。1.2熊果酸对静止型hsc活化过程中p67phox蛋白表达的影响原代hscs经tgf-β刺激24h后nox亚基p67phox蛋白表达显著高于空白对照组(p0.01);熊果酸组p67phox蛋白表达则明显低于空白对照组(p0.05);用tgf-β刺激原代hscs之前加入熊果酸进行干预后p67phox蛋白水平较单纯tgf-β刺激组显著降低(p0.01),其与nox抑制剂dpi干预组相比p67phox蛋白的表达无统计学差异(p0.05)。上述结果表明,静止型hsc活化过程中p67phox蛋白表达明显升高,而熊果酸干预能够有效抑制静止型hsc活化过程中nox亚基p67phox的蛋白表达。1.3熊果酸对静止型hsc活化过程中p22phox蛋白表达的影响tgf-β刺激原代hscs24h后细胞内p22phox的蛋白表达明显高于空白对照组(p0.01);熊果酸组p22phox蛋白表达明显低于空白对照组(p0.05);tgf-β作用于原代hscs前使用熊果酸干预使细胞内p22phox蛋白水平较单纯tgf-β刺激组均显著降低(p0.01),且与dpi干预组相比无明显统计学差异(p0.05)。上述结果表明,静止型hsc活化过程中p22phox蛋白表达水平明显升高,而熊果酸干预能够有效抑制静止型hsc活化过程中nox亚基p22phox的蛋白表达。2.熊果酸对静止型hsc活化过程中nox亚基mrna表达的影响2.1熊果酸对静止型hsc活化过程中rac1mrna表达的影响用tgf-β刺激原代hscs12h后细胞内rac1mrna表达明显高于空白对照组(p0.01);熊果酸组原代hscs内rac1mrna表达则显著低于空白对照组(p0.05);在tgf-β刺激原代hscs前分别给予熊果酸、dpi干预后rac1mrna表达较单纯tgf-β组均明显降低(均p0.05),且该两组间rac1mrna表达统计学差异不明显(p0.05)。上述结果表明,静止型hsc活化过程中rac1mrna表达水平明显升高,而熊果酸干预能够有效抑制静止型hsc活化过程中nox亚基rac1的mrna表达。2.2熊果酸对静止型hsc活化过程中p22phoxmrna表达的影响tgf-β刺激组原代hscs内p22phoxmrna表达明显高于空白对照组(p0.01);熊果酸组p22phoxmrna表达则明显低于空白对照组(p0.01);在tgf-β刺激前给予熊果酸干预p22phoxmrna表达较单纯tgf-β组明显降低(p0.01),且其效果与nox抑制剂dpi干预组无明显差异(p0.05)。上述结果表明,静止型hsc活化过程中p22phoxmrna表达水平明显升高,而熊果酸干预能够有效抑制静止型hsc活化过程中nox亚基p22phox的mrna表达。3.熊果酸对静止型hsc活化过程中α-sma蛋白表达的影响原代hscs经tgf-β刺激24h后α-sma蛋白表达明高于空白对照组(p0.05);熊果酸作用于自然培养的原代hscs后α-sma蛋白表达水平较空白对照组明显降低(p0.05);在tgf-β刺激前分别使用熊果酸、nox抑制剂dpi进行干预后α-sma蛋白的表达较单纯tgf-β刺激组均显著下降(均p0.01),较空白对照也均明显下降(均p0.05),且两组间α-sma的表达无明显统计学差异(p0.05)。上述结果表明,nox参与诱导hsc的活化,熊果酸干预能够有效降低静止型hsc活化过程中α-sma的蛋白表达,抑制静止型hsc的活化。4.熊果酸对静止型hsc活化过程中i型胶原mrna表达的影响tgf-β刺激原代hscs12h后i型胶原mrna表达则明显高于空白对照组(p0.05);熊果酸组i型胶原mrna表达明显低于空白对照组(p0.05);在tgf-β刺激前分别给予熊果酸、dpi干预后i型胶原mrna表达较单纯tgf-β刺激组均明显降低(均p0.01),两组间i型胶原mrna表达无明显差异(p0.05)。上述结果表明,nox参与调控hsc合成i型胶原,熊果酸干预能够有效降低静止型hsc活化过程中i型胶原的mrna表达。结论:1.在静止型hsc活化过程中nox亚基gp91phox、p67phox、p22phox、rac1的蛋白及mrna表达明显升高,熊果酸干预能够抑制nox亚基的表达上调。2.nox参与调控静止型hsc的活化及hsc内胶原合成,熊果酸干预能有效抑制静止型hsc活化及hsc内胶原合成,其机制可能与熊果酸抑制hsc活化过程中NOX亚基的表达有关。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2

【参考文献】

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本文编号：1211173