肝细胞去分化及其机制

发布时间：2017-11-23 17:25

  本文关键词：肝细胞去分化及其机制

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【摘要】：【研究背景及目的】传统观点认为组织发育和细胞分化是一个单向性的过程,即由干细胞/前体细胞向体细胞分化。因此,在组织正常更新或损伤情况下,干细胞/前体细胞在组织再生过程中发挥重要作用。然而,到目前为止,干细胞/前体细胞的这种重要作用只在仅有的几个器官中得到证实,其他大多数器官中则缺乏相应的研究证据。肝脏就是其中之一。肝脏中的干细胞/前体细胞称为肝前体细胞(Hepatic Progenitor Cells,HPCs),其可向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化。由于HPCs可表达多种细胞标志物而缺乏特异性标志物,其来源及到目前为止尚不十分清楚。传统观点认为HPCs来自胆管末端的Hering管,也有研究提示骨髓干细胞、肝星状细胞等也是HPCs来源之一。此外,也有研究显示肝细胞可作为HPcs的另一来源。肝脏由于其特殊的位置和功能,使其成为生物体中非常特殊的器官之一。作为其主要实质构成及功能发生单位,肝细胞也因此拥有与其他体细胞不同的生理特性,如可无限增殖及向胆管上皮细胞转化等。最新的体内外研究显示肝细胞也可去分化为HPCs。然而,这些研究均缺乏严谨的谱系追踪证据加以证实,也未对肝细胞去分化的机制做深一步的研究。肝细胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α,HNF4α)是肝脏富集的一类转录因子,在肝脏发育和功能维持中发挥重要作用。研究显示HNF4α还可促进肝癌细胞向成熟肝细胞分化,但其在成熟肝细胞去分化中的作用未见报道。基于以上研究背景,本研究利用多种转基因小鼠及动物模型明确不同肝损伤情况下肝细胞在肝脏再生中的作用及肝细胞是否可作为肝前体细胞来源之一,并初步探讨其机制。【实验方法】一、肝细胞特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠的构建甲状腺结合球蛋白(TBG)为肝细胞特异性表达蛋白。本研究采用mTomato-mGFP双重荧光标记小鼠,携带TBG启动子及内含子的血清Ⅷ型腺相关病毒(AAV8-TBG)可驱动下游基因在成熟肝细胞中特异表达。小鼠尾静脉注射携带Cre重组酶基因的AAV8-TBG(AAV8-TBG-Cre)后使肝细胞特异性标记GFP而呈现绿色荧光,其他非肝细胞呈现红色荧光。二、明确急性肝损伤时肝脏再生情况mTomato-mGFP小鼠尾静脉注射AAV8-TBG-Cre标记肝细胞后,给予腹腔注射四氯化碳每周两次注射两周,或行肝大部切除术,构建急性肝损伤模型。观察肝脏组织中红色和绿色荧光标记区域的细胞变化情况。免疫荧光检测HNF4α与红色或绿色荧光表达。三、明确慢性肝损伤时肝细胞是否可以去分化为HPCs上述老鼠继续延长DDC饮食造模时间,免疫荧光检测PCK、Ep CAM、Sox9等HPCs标志物表达并追踪其荧光标记。在CDE饮食模型中重复观察上述现象。分离小鼠原代肝细胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR和Western blot检测成熟肝细胞及HPCs相关基因表达。四、初步明确HNF4α表达在肝细胞去分化中的作用分离DDC饮食不同时间点小鼠原代肝细胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR和Westernblot检测各时间点HNF4α表达量变化。将mTomato-mGFP小鼠与HNF4aflox/flox小鼠杂交后,尾静脉注射AAV8-TBG-Cre,构建肝细胞特异性敲除HNF4α转基因小鼠,免疫荧光检测肝脏组织中Sox9的表达。分离小鼠原代肝细胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR和Western blot检测成熟肝细胞及HPCs相关基因表达。【实验结果】一、成功构建肝细胞特异性表达GFP的转基因小鼠mTomato-mGFP小鼠尾静脉注射AAV8-TBG-Cre后可见肝脏组织内除汇管区及间质部位细胞表达绿色荧光外,几乎所有肝细胞形态的细胞表达绿色荧光。免疫荧光对多种细胞特异性标志物如HNF4α、PCK、Sox9、GFAP、α-SMA、F4/80、CD34检测,发现所有表达绿色荧光的细胞均为肝细胞,而其他细胞包括胆管上皮细胞、肝星状细胞、Kupffer细胞、血管内皮细胞等则表达红色荧光。表明该模式动物可明确的区分出肝细胞和非肝细胞,结合免疫荧光技术我们可直观的探究肝细胞的来源和去路,是进行谱系追踪研究肝细胞去分化的理想动物模型。二、急性肝损伤后再生肝细胞来源于肝细胞自我复制mTomato-mGFP小鼠尾静脉注射AAV8-TBG-Cre标记肝细胞,腹腔注射四氯化碳或行肝大部切除术构建急性肝损伤模型,免疫荧光检测发现门静脉区域红色荧光标记的细胞数量无明显增加,也未发现红色荧光标记的肝细胞样细胞的出现,HNF4α检测也发现所有HNF4α阳性的细胞均表达绿色荧光,未见红色荧光标记的HNF4α阳性的细胞出现。提示急性肝损伤后再生过程中残存肝细胞自我复制是新生肝细胞的唯一来源。三、慢性肝损伤时肝细胞可发生去分化1、继续进行DDC饮食4-12周,每隔一周检测各时间点肝脏再生情况。发现随着DDC饮食时间的延长,散在的PCK阳性的细胞逐渐增多,至DDC饮食6周开始出现绿色荧光标记的PCK阳性的细胞并逐渐增多。多种HPCs标志物检测也发现了散在的绿色荧光标记的Sox9、Ep CAM阳性的细胞。说明DDC饮食所致慢性肝损伤达一定程度时部分肝细胞发生了去分化。2、普通C57小鼠进行DDC饮食造模4周,每隔一周分离各时间点小鼠原代肝细胞,收集RNSA和蛋白。RT-PCR检测发现成熟肝细胞相关基因的表达逐渐降低,HPCs相关标志物的表达明显增加。Western blot检测发现随着DDC饮食延长,Sox9的表达逐渐增加。分别在RNA和蛋白水平证实了肝细胞去分化现象。3、mTomato-mGFP小鼠尾静脉注射AAV8-TBG-Cre标记肝细胞,给予CDE饮食造模,观察肝脏组织再生情况。我们同样观察到随着CDE饮食的延长,门静脉区域红色荧光标记的细胞数量逐渐增多。至CDE饮食6周开始出现散在的绿色荧光标记的Sox9、PCK、Ep CAM阳性的细胞。提示CDE饮食所致慢性肝损伤中肝细胞去分化现象仍然存在。四、肝细胞特异性敲除HNF4α后可发生自发去分化1、普通C57小鼠进行DDC饮食造模4周,每隔一周分离各时间点小鼠原代肝细胞,收集RNA和蛋白,RT-PCR、Western blot检测发现,随着DDC饮食的延长,HPCs标志物表达量增加的同时HNF4α的表达量逐渐减少。提示肝细胞内HNF4α可能在损伤后肝细胞去分化过程中发挥一定的作用。2、构建肝细胞特异性敲除HNF4α小鼠,免疫荧光检测发现在敲除HNF4α的肝细胞中,约50%的细胞表达Sox9。分离原代肝细胞,收集RNA和蛋白。RT-PCR检测发现HNF4α敲除小鼠成熟肝细胞相关基因的表达逐渐降低,HPCs相关标志物的表达明显增加。Western blot检测也发现HNF4α敲除小鼠肝细胞中Sox9的表达明显增加。提示HNF4α在维持成熟肝细胞功能中发挥重要作用,其表达下降是调控肝细胞去分化的重要机制之一。【结论】一、急性肝脏损伤时肝细胞通过自我复制完成肝脏再生。二、慢性肝脏损伤时肝细胞可去分化为HPCs。三、HNF4α表达下降在肝细胞去分化中起重要作用。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575

【参考文献】

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1 Dharmendra Kumar;Thirumala R Talluri;Taruna Anand;Wilfried A Kues;;Induced pluripotent stem cells: Mechanisms, achievements and perspectives in farm animals[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

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本文编号：1219256