京尼平苷酸基于FXR抗ANIT诱导胆汁淤积大鼠保肝利胆机制研究

发布时间：2017-12-04 10:10

  本文关键词：京尼平苷酸基于FXR抗ANIT诱导胆汁淤积大鼠保肝利胆机制研究

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【摘要】：目的：胆汁淤积(Cholestasis),是指肝细胞或者胆管水平的胆汁生成和排泄功能障碍、致使胆汁到达十二指肠的量减少,胆汁成分反流入血,称为胆汁淤积或淤胆,若血中胆汁酸和胆红素均增高则称为胆汁淤积性黄疸。南方地区气候为潮湿闷热多雨,湿热病症中的胆汁淤积十分常见且发病率极高。胆汁淤积症是现代临床常见病种,其发病的机制极其复杂,临床治疗也缺乏行之有效的药物。传统医学中,清热利湿中药在抗胆汁淤积方面有其独特的疗效和优势,尤其以富含环烯醚萜类中药见长,但其作用机制尚无明确定论,本文考察环烯醚萜化合物京尼平苷酸在保肝利胆作用的有效性和机制探究,为其进一步开发提供基础理论数据。方法：1.京尼平苷酸(GPA)纯度测定及其小鼠体内急性毒性实验建立HPLC法分析测定京尼平苷酸纯度以及在昆明种小鼠体内进行急性毒性实验并确定GPA的半数致死量(LD50)。死亡小鼠及时尸检,观察其主要器官组织有无异常,其余小鼠在观察期结束后处死解剖,观察其主要器官有无异常。给药前及给药后1周称量小鼠体重,并进行比较。2.GPA对α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导大鼠肝内胆汁淤积保肝利胆药效及机制研究第一组：空白对照组(1:Blank control):市售大豆油灌1mL/100gB.W./d连续灌胃7天(d);第二组：模型对照组(2:ANIT treated model):第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg,其余每天灌胃同空白对照组灌大豆油1mL/100g B.W./d;第三组：阳性对照组(3:ANIT+100 mg/kg B.W.UDA):灌胃熊去氧胆酸100 mg/kg/d,连续灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;第四组：京尼平苷酸高剂量组(4:ANIT+100 mg/kg B.W. GPA):灌胃京尼平苷酸100 mg/kg,连续灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;第五组：京尼平苷酸中剂量组(5:ANIT+50 mg/kg B.W. GPA):灌胃京尼平苷酸50 mg/kg,连续灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;第六组：京尼平苷酸低剂量组(6:ANIT+25 mg/kg B.W. GPA):灌胃京尼平苷酸25 mg/kg,连续灌胃7天,在第5天一次性灌胃ANIT 65 mg/kg;连续灌胃给药7天,其中第5天除空白对照组外其它组灌胃给予ANIT(65 mg/kg)一次。第7天末次给药1h后,腹腔注射20%的乌拉坦麻醉,固定,进行胆总管插管手术,分段收集胆汁,腹主动脉取血,摘取肝脏,胆汁和肝重称重,检测胆汁叶1GSH/TB/DB /TBA以及血清GOT/GPT/γ-GT/TB/DB/TBA量或活性,H-E染色考察GPA对ANIT诱发大鼠的肝内胆汁淤积的肝组织病理学观察,免疫荧光双染法,检测肝组织中MRP2/BSEP在组织中位置表达,Western Blot/RT-PCR法检测GPA干预SNIT诱导的肝内胆汁淤积模型大鼠的肝组织中MRP2/BSEP/FXR蛋白／基因表达。3.GPA在正常和ANIT(100mg/kgB.W.)诱导的胆汁淤积大鼠体内的药动学比较分析GPA一次灌胃给24只正常大鼠和24只ANIT胆汁淤积模型大鼠,各分为3组(高、中、低,GPA剂量为100,50,25mg/kg),每组8只。建立HPLC-UV法测定各组大鼠分别于给药前,及药后5,15,30 min,以及1,2,3,4,6,8,12,24 h时间点GPA血药浓度,用PK_solution 2.0计算各组的药动学参数。Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm,5μm)色谱柱；流动相：乙腈-0.5%冰醋酸(28：72)；检测波长：238 nm；检测15 min；流速：1.0mL/min;柱温：30℃；进样量：10μL。4.GPA对BRL-3A的细胞活性及增殖测定运用CCK-8法测定BRL-3A细胞分别按2000、4000、6000个／孔的细胞数量接种的生长曲线,根据细胞浓度和培养天数,确定最佳细胞种植密度。用DMEM高糖培养基将GPA稀释成浓度为500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.10 mmol/L的含GPA培养基。细胞以4000个／孔的数量,重复5孔接种于96孔板,培养48 h,依次加入上述浓度含药培养基培养24 h,用CCK-8检测,根据细胞存活率计算GPA对BRL-3A的IC50值。5.GPA对BRL-3A大鼠肝细胞中FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表达水平的影响将细胞分为正常对照组(不加处理因素,常规条件下培养),GPA高、中、低剂量组(加入终浓度为4、1、0.25 mmol/L的GPA诱导48 h,每组两块6孔板。48 h后,收集蛋白和RNA样本。WB和RT-PCR法检测GPA干预BRL-3A大鼠肝细胞中MRP2/BSEP/FXR蛋白和基因表达6.GPA对siRNAFXR介导BRL-3A细胞FXR基因沉默后细胞中MRP2/BSEP蛋白和基因的表达实验分为正常组(即常规培养细胞,未进行任何处理)、阴性对照组(及空白转染)、siRNA-FXR组(即转染siRNA-FXR)、siRNA-FXR+GPA 4 mM组(即转染siRNA-FXR后用4 mM的GPA进行干预)、siRNA-FXR+GPA 1 mM组(即转染siRNA-FXR后用1mM的GPA进行干预)、siFXR+GPA 0.25 mM组(即转染siRNA-FXR后用0.25 mM的GPA进行干预)。转染6 h后,更换培养基继续正常培养至24 h,24 h后在按各组分组情况按GPA的量相应加入。WB和RT-PCR法法检测GPA对siRNA-FXR转染后细胞中FXR/MRP2/BSEP的蛋白和基因水平的影响。结果：1.根据测定实验使用的GPA的纯度为98.69%为纯度较高的单一化合物；使用Bliss法测定GPA小鼠半数致死量为LD50=2.6204 g/kg,,化合物经口急性毒性分级标准小鼠一次经灌胃LD50大于15000 mg/kg,可认定为无毒化合物,故此实验表明京尼平苷酸口服给药安全范围大。2.用一次灌胃65 mg/kg的ANIT在给药48 h后具有明显的致胆汁淤积的效果；与空白对照组,ANIT诱导组明显抑制胆汁流量(P0.01),同时明显降低了胆汁中TB/DB/TBA含量(P0.01),显著(P0.01)升高了血清中TB/DB/TBA的含量和GOT/GPT/y-GT酶活性,肝组织病理图显示细胞水肿,重度的炎细胞浸润,肝血窦内有淤胆,有大量胆汁横溢,胆管受损；与ANIT诱导组比较,100 mg/kg GPA高剂量组的胆汁流量显著提高(P0.01),胆汁中TB/DB/TBA/GSH的含量也显著提高(P0.01),而血清中TB/DB/TBA的含量和GOT/GPT/y-GT酶活性显著降低(P0.01),肝组织病变程度较ANIT组显著改善。可见,GPA的作用与剂量呈现正相关。3.免疫荧光实验发现,与空白对照组比较,65 mg/kg的ANIT的诱导能明显抑制BSEP的表达；与ANIT模型诱导组比较,在使用UDA和GPA保护的干预治疗的大鼠肝组织中BSEP的表达区域明显增加,且GPA的剂量高低对BSEP表达区域的增加也呈现明显的剂量正相关；然而,在免疫荧光双染实验中,细胞质和胞浆中MRP2的表达,没有明显的表现出差异。WB和RT-PCR检测表明,与空白对照组比较,65 mg/kg的ANIT诱导的各组大鼠肝组织中FXR/MRP2/BSEP的蛋白和基因表达量极显著性的降低(P0.01)；而与ANIT诱导组,灌服熊去氧胆酸,FXR/MRP2/BSEP的蛋白和基因表达水平有较明显的提高(P0.01)：用GPA给予7天的预防性治疗,高剂量的GPA对FXR/MRP2/BSEP蛋白何人基因表现出极明显的提高(P0.01),中剂量的GPA也表现出明显上调FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表达水平(P0.05),GPA上调FXR/MRP2/BSEP蛋白水平的能力与其剂量呈现正相关关系,25 mg/kg GPA的预防给药与一次性给予65 mg/kg ANIT的模型诱导组比较,在蛋白水平表达上未见明显区别,而基因出明显提高的效果(P0.05)。4.正常大鼠给予高、中、低剂量的GPA对药动学参数CL和T1/2并无明显的影响,统计学上无差别；用100 mg/kg ANIT造模大鼠和正常大鼠比较,ANIT造模大鼠的CL和T1/2明显要比正常大鼠延长,统计学有差异(P0.05)；从Cmax的结果上看,ANIT造模大鼠的Cmax均比正常组的大鼠要高,且具有统计学比较差异(P0.05)；从平均驻留时间MRT0→t上看,ANIT造模大鼠体内的GPA的MRT0→t相对正常大鼠的均延长30%,且不同剂量均有延长,在统计学上有差异(P0.05)；从AUC0→t上看,GPA在胆汁淤积大鼠体内的AUC0→t明显高于正常大鼠,且高剂量提高21%、中剂量提高22%、低剂量提高26%,且经统计学检验,均有显著性差异。5. BRL-3A细胞以4000个／孔数量,生长速度符合实验要求。实验时按125倍的96孔板细胞接种数量,接种于6孔板中,即5×105个／孔接种。GPA对BRL-3A细胞的半数抑制浓度IC50的测定,半数抑制率浓度,得到IC50=39.37mM,依据不大于十分之一的剂量作为给药高剂量4 mM,1 mM为中剂量,0.25 mM为低剂量。6.WB和RT-PCR法检测GPA干扰BRL-3A细胞中FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因表达水平,不同剂量的GPA对BRL-3A处理48 h后,与未使用GPA干扰的BRL-3A细胞相比,4 mM剂量的GPA能够非常显著(P0.01)上调BRL-3A细胞中FXR/MRP2/BSEP蛋白和基因的表达水平；1mM剂量的GPA能够非常显著的上调(P0.01)上调BRL-3A细胞中FXR/BSEP蛋白的表达量,同时显著(P0.05)上调MRP2的蛋白表达量,1 mM剂量的GPA能够显著上调(P0.05)BRL-3A细胞中FXR/BSEP基因水平,极显著(P0.01)上调MRP2基因的水平；0.25 mM的GPA对蛋白表达无统计学差异,0.25mM的GPA对BRL-3A细胞中MRP2具有显著的上调作用(P0.05)。7.WB和RT-PCR检测表明,FXR基因沉默后,与正常培养的BRL-3A细胞相比；转染siRNA-FXR的细胞,其FXR的基因和蛋白表达水平均显著降低(P0.01),MRP2和BSEP的基因和蛋白水平也显著降低(P0.01)；而与空白转染组(阴性转染组,转染了siRNA-Negative)组相比,转染组的FXR、MRP2和BSEP的表达水平均降低,具有统计学意义(P0.01)；而阴性转染组与正常组相比,FXR的表达水平没有差异(P0.05)。与转染siRNA-FXR的各组细胞相比,siRNA-FXR+4 mM GPA组、siRNA-FXR+1 mM GPA组、siRNA-FXR+0.25 mM GPA组中的FXR、MRP2和BSEP基因和蛋白水平,均有一定的提高,且呈剂量正相关,其中siRNA-FXR+4 mM GPA组具有显著性差异(P0.01)。结论：京尼平苷酸对ANIT诱导的胆汁淤积模型大鼠具有保肝利胆药效,结合体内外研究及沉默FXR实验发现,GPA的保肝利胆机制可能是其通过核受体FXR调节胆汁酸转运体MRP2和BSEP功能改变调节胆汁转运体功能实现的。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575

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本文编号：1250632