MEAN通过干扰PTB抑制HCV复制

发布时间：2017-12-10 16:01

  本文关键词：MEAN通过干扰PTB抑制HCV复制

  更多相关文章： HCV感染 JC1病毒 HCV IRES PTB 胞核-胞质转位 mRNA稳定性

【摘要】：研究背景与目的 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是黄病毒属的单股正链RNA病毒,经血液传播、嗜肝性感染,引起急/慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前全球约有1.85亿HCV感染者,感染率约为3%。每年新增感染者逾300万,死亡约50万。目前的疗法成功率仅有45%左右,而且周期长,副作用大。迄今全球仍没有HCV预防性疫苗,不能阻断HCV的传播。在今后相当长的时间内丙肝仍然是威胁人类健康的重要传染病。因此积极寻找有效治疗HCV的办法至关重要。多嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)作为一种普遍存在的多效应细胞因子,与多种病毒的生命周期相关。在核内参与前mRNA的选择性剪接,在胞质中调节包括HCV在内的多种病毒的翻译和复制过程。因此,PTB在HCV RNA的转录后调节过程中发挥作用。本研究拟用JCl-Luc嵌合病毒感染Huh7.5.1细胞构建HCV细胞模型,探讨小分子化合物MEAN (6-methoxyethylamino-numonafide)对PTB质核穿梭及HCV复制的影响。 研究方法 1. MEAN抗HCV效果分析 96孔细胞芯片板中,浓度梯度(0,0.31,0.63,1.25,2.5,5,10,20μM)的MEAN作用Huh7.5.1细胞72h,实时无标记细胞分析(real time cellular analysis, RTCA)技术检测MEAN的细胞毒性。HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体后转染Huh7.5.1细胞,收集细胞上清再次孵育Huh7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型(Huh7.5.1-JC1),感染后24h给予浓度梯度(0,0.63,1.25,2.5,5,10μM)的MEAN处理细胞48h后检测荧光素酶水平判断MEAN抗HCV效果。并通过Q-PCR和western blot分别检测HCV RNA及核心蛋白(Core)的水平验证MEAN的抗HCV效应。免疫荧光实验检测Core蛋白进一部验证MEAN对HCV感染的抑制效果。MEAN对E2突变株N415D和G451R病毒复制的效应以及MEAN与干扰素α (Interferon α, IFN α)、ITX5061及利巴韦林(Ribavirin, RBV)联合药效也通过检测荧光素酶水平进行评估。 2. MEAN抗HCV的机制研究 HCV IRES双荧光素酶报告基因质粒转染Huh7.5.1细胞24h后给予MEAN处理48h后检测双荧光素酶水平研究MEAN对HCV IRES介导的翻译的影响。siRNA干扰实验验证PTB在HCV复制中的作用。此外,Q-PCR, western blot、免疫荧光实验及异核体实验检测MEAN对PTB表达水平及其胞核-胞质穿梭的影响。mRNA稳定性实验验证MEAN对PTB mRNA稳定性的影响。 研究结果 1. MEAN抑制HCV复制 1)荧光素酶实验证实MEAN可以高效抑制JC1病毒复制(p0.05),半数有效浓度(EC50)为2.36±0.29州。 2) Q-PCR和western blot结果显示MEAN剂量依赖性的抑制HCV RNA及核心蛋白水平(p0.05),进一步证实了MEAN对HCV复制的抑制效应。 3)免疫荧光实验显示MEAN可显著减少Core+细胞。 4)荧光素酶实验证实MEAN可以显著抑制突变病毒N415D及G451R的复制,EC50分别为3.56±0.08和3.71±0.14μM。 5)药物联合实验发现MEAN与IFN α、ITX5061和RBV可协同抑制HCV的复制。 2.MEAN抑制PTB的表达及其质核穿梭 1)双荧光素酶实验证实MEAN对HCV IRES介导的翻译抑制效果不明显(p0.05)。 2) siRNA干扰PTB表达后,HCV复制水平显著降低(p0.05)。 3) Q-PCR和Western Blot证实,HCV感染后PTB表达显著升高；而MEAN可抑制其高表达(p0.05)。 4) mRNA稳定性实验证实MEAN可缩短PTB mRNA半衰期。 5) western blot和免疫荧光实验证实HCV感染后PTB的胞核-胞质转位增强,MEAN可抑制其胞核-胞质转位(p0.05)。 6)异核体实验进一步证实MEAN可抑制EGFP-PTB的胞核-胞质转位。研究结论 1. MEAN显著抑制HCV复制。 2. MEAN通过抑制PTB胞核-胞质转位发挥抗HCV效应。 3. MEAN通过缩短PTB mRNA的半衰期而抑制其胞核-胞质转位。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.63

【共引文献】

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本文编号：1275028