靶向调控β-arrestin2的表达对肝纤维化星状细胞胶原产生的影响

发布时间：2017-12-16 16:20

  本文关键词：靶向调控β-arrestin2的表达对肝纤维化星状细胞胶原产生的影响

  更多相关文章： β-arrestin2 TGF-β1 TGF-βⅢ型受体 HSC 肝纤维化 细胞外基质

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝组织内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度增生与异常沉积,导致肝脏结构、功能异常的病理变化。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维化ECM的主要来源。转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是引起HSC活化并产生胶原的主要细胞因子。β-arrestin2属于arrestin家族,是众所周知的G蛋白偶联受体的调节蛋白,同时作为支架蛋白和连接蛋白,参与受体在胞内的信号转导。近年来研究显示,β-arrestin2的异常表达与纤维化疾病的发生、发展有关。本研究探讨β-arrestin2对HSC胶原产生的影响,及其机制是否与调节TGF-βⅢ型受体(the type Ⅲ TGF-β receptor, TβRⅢ)相关,为肝纤维化的防治提供新的靶点。本实验首先建立了猪血清(porcine serum, PS)诱导的肝纤维化大鼠模型,检测了造模不同时间点大鼠肝脏β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达变化；体外以TGF-β1刺激的HSC做为胶原产生模型,检测了TGF-β1刺激不同时间点HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达情况及Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况。采用激光共聚焦、免疫共沉淀、针对TβRⅢ和β-arrestin2的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),进一步探讨β-arrestin2对HSC胶原生成的影响及与TPRIII的相互作用情况。目的：体外建立猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型；体外选取大鼠HSC-T6细胞株,TGF-β1刺激不同时间,并采用TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA干扰。观察β-arrestin2、TβRⅢ、胶原表达及相关信号通路的变化,探讨β-arrestin2与TβRⅢ的相互作用,阐明β-arrestin2在HSC胶原产生中的作用及机制,为防治肝纤维化提供新的靶点。方法：Wistar大鼠腹腔注射无菌猪血清,每周2次,诱导肝纤维化模型。分别于造模第3、6、9、12、16周末次注射24h后处死大鼠。Western blot法检测肝脏中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平的变化。体外选用HSC-T6细胞,Western blot法检测TGF-β1刺激不同时间点(0.25 h、0.5h、1 h、4 h、8 h、12 h)HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达变化,以及Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况；分别使用针对TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA转染HSC,采用Western blot法检测转染后TβRⅢ、β-arrestin2、胶原的表达变化和Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况；激光共聚焦和免疫共沉淀检测β-arrestin2、TβRⅢ的相互作用。结果：1.猪血清诱导的肝纤维化模型大鼠肝脏中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达情况Western blot检测结果显示,肝脏Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表达随肝纤维化的.形成增高,β-arrestin2的表达也逐渐增高：同时,随造模时间的延长TGF-β1的表达升高,而TβRⅢ随之降低,TβRⅡ则无明显变化。相关性分析结果表明,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ与β-arrestin2的表达呈正相关,而TβRⅢ与β-arrestin2的表达呈负相关。2. TGF-β1刺激的HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达变化,以及Smad2、Smad3和Akt信号通路的激活情况Western blot检测结果显示,TGF-β1刺激HSC不同时间点(0.25 h、0.5 h、1 h、4 h、8 h、 12 h),β-arrestin2的表达随着TGF-β1的刺激时间延长而升高,TβRⅢ表达降低。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达也明显升高。p-Smad2、p-Smad3分别在0.5h和0.25h表达最高,p-Akt在4h达到最高。3. TβRⅢ siRNA转染HSC后TβRⅢ、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达变化为了研究TβRⅢ在HSC中的作用,向HSC转染了针对TβRⅢ的siRNA。 Western blot检测结果发现,转染TβRⅢ siRNA后,与对照组相比,HSC中TβRⅢ表达下降,而TGF-β1刺激的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达升高。4. TβRⅢ siRNA转染HSC后Smad2、Smad3和Akt信号通路的激活情况进一步研究TβRⅢ对TGF-β1激活的信号通路的影响,Western blot检测了Smad2、Smad3和Akt的激活情况。结果发现,转染TβRⅢ siRNA后,与对照组相比,可明显促进TGF-β1刺激的HSC中Smad2、Smad3和Akt信号通路的激活。5. β-arrestin2、siRNA对HSC中β-arrestin2、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表达的影响为了研究β-arrestin2对HSC胶原产生的影响,向细胞转染了β-arrestin2 siRNA。 Western blot检测发现,转染β-arrestin2 siRNA后,与对照组相比,TGF-β1刺激的HSC中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表达下降。6. β-arrestin2 siRNA转染HSC对Smad2、Smad3和Akt信号通路激活的影响Western blot检测发现,转染β-arrestin2 siRNA后,与对照组相比,TGF-β1刺激的HSC中p-Smad2、p-Smad3和p-Akt的表达下降,而Smad2、Smad3和Akt的表达没有明显变化。7. TGF-β1刺激的HSC中β-arrestin2与TβRⅢ的相互作用激光共聚焦与免疫共沉淀结果显示,β-arrestin2与TβRⅢ在TGF-β1刺激的HSC中存在共定位,TGF-β1刺激后,β-arrestin2与TβRⅢ共沉淀增强。转染β-arrestin2 siRNA后,与对照组相比,细胞中TβRⅢ表达升高,但TβRⅢ和β-arrestin2的共沉淀作用无明显变化。提示抑制β-arrestin2减弱β-arrestin2与TβRⅢ的相互作用,可能上调了TβRⅢ对Smad和Akt通路的抑制作用。结论：1.在肝纤维化大鼠造模过程中,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达逐渐升高,β-arrestin2的表达也增高,而TβRⅢ的表达减少,TβRⅡ则无明显变化。相关性分析结果提示,在肝纤维化过程中,β-arrestin2的表达与胶原表达成正相关,可能在HSC胶原生成的过程中发挥作用。2. TGF-β1刺激的HSC中,β-arrestin2、Collagen I、Collagen III的表达升高,TβRIII的表达降低。β-arrestin2与TβRIII在HSC中存在相互作用,且TGF-β1刺激后相互作用增强。3.HSC转染针对TβRIII siRNA后,胶原相关蛋白的表达增高；同时,Smad2、Smad3和Akt信号通路激活水平升高。结果显示,降低TβRIII的表达可能促进了Smad2、 Smad3和Akt信号通路的激活,进而促进了胶原表达。4.HSC转染针对β-arrestin2 siRNA后,TGF-β1的刺激无法增强β-arrestin2与TβRIII的相互作用,转染后细胞中胶原相关蛋白的表达被抑制,Smad2、Smad3和Akt信号通路的激活都得到了抑制。以上结果提示,β-arrestin2可能通过增强与TβRIII的作用,减弱了TβRIII对Smad2/3、Akt通路的抑制作用,进而促进胶原产生。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2

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本文编号：1296671