布拉氏酵母菌对NAFLD小鼠肝脏脂肪变及肠道菌群变化的初步研究

发布时间：2017-12-18 07:19

  本文关键词：布拉氏酵母菌对NAFLD小鼠肝脏脂肪变及肠道菌群变化的初步研究

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【摘要】：目的:1建立非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的动物模型;2予布拉氏酵母菌散剂灌胃进行干预,观察肝脏组织病理学、生化指标、蛋白表达、免疫学及肠道菌群变化,初步探讨布拉氏酵母菌对小鼠NAFLD的疗效及作用机制。方法:1 38只雄性C57BL/6小鼠,6~8周龄,自由摄食AIN93对照饲料7天后,随机分为Control组及西方饮食(Western diet,WD)组,Control组16只,WD组22只。分别给予对照饮食及西方饮食(高脂肪高糖饮食),造模时间33周。33周后从WD组中随机抽取12只小鼠,分为布拉氏酵母菌灌胃组(TB,n=6)及灌胃对照组(TD,n=6),分别给予布拉氏酵母菌(5.98×108 CFU/kg/day)及果糖(284mg/kg/day)+乳糖(19mg/kg/day)灌胃,每日1次,共灌胃6周,6周后处死小鼠。2定期观察小鼠的进食、精神状态及毛发光泽度等,每周称量小鼠体重并记录。3观察各组小鼠肝脏外形变化,记录肝重,计算并比较肝重指数。4应用苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色观察肝组织病理学的改变。5检测布拉氏酵母菌干预前后血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)及丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)及内毒素的变化情况。6应用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitation PCR,Real-time QPCR)方法检测布拉氏酵母菌干预前后肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)m RNA、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)m RNA、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)m RNA的表达情况。7提取肝、脾组织中的淋巴细胞行流式细胞学检测,了解布拉氏酵母菌干预前后肝、脾组织中CD4+/CD8+比值、CD4+T细胞IL-17、RORγt的表达情况。8应用免疫组织化学的方法检测布拉氏酵母菌干预前后肝脏组织中α-SMA及TNF-α的表达情况。9应用16s r RNA宏基因组测序的方法了解布拉氏酵母菌干预后小鼠肠道菌群的变化情况。结果:1西方饮食喂养C57BL/6雄性小鼠33周后行肝脏HE染色:Control组肝脏肝细胞大小及排列正常,WD组可见弥漫性肝细胞脂肪变性,有炎症细胞浸润,造模成功。灌胃后,与TD组比较,TB组肝脏脂肪变程度及炎症程度减轻,差异有统计学意义(P0.05)。2与Control组比较,WD组血清中ALT、AST及TG均增高,差异有统计学意义(P0.05);同TD组比较,TB组血清中ALT、AST及TG均降低,差异有统计学意义(P0.05)。3 Real-time QPCR:与Control组比较,WD组TGF-β、TNF-α、α-SMA m RNA的表达量增高,差异有统计学意义(P0.05),TB组较TD组TNF-αm RNA表达量减少,差异有统计学意义(P0.05),而TD组及TB组之间TGF-βm RNA、α-SMA m RNA均无明显变化(P0.05)。4血清IL-17:与Control组比较,WD组IL-17表达量升高,差异有统计学意义(P0.05);与TD组比较,TB组IL-17的表达量降低,差异有统计学意义(P0.05)。5血清内毒素:WD组内毒素水平较Control组升高,差异有统计学意义(P0.05),与TD组比较,TB组内毒素水平下降(P0.05)。6流式细胞学检测结果示:肝脏:与Control组比较,WD组CD4+/CD8+、CD4+T RORγt的表达量升高,差异有统计学意义(P0.05),CD4+T IL-17表达量未见明显差异(P0.05),同TD组比较,TB组CD4+/CD8+、CD4+T RORγt表达量下降,差异有统计学意义(P0.05),CD4+T IL-17的表达量未见明显差异(P0.05);脾脏:CD4+/CD8+、CD4+T RORγt、CD4+T IL-17表达量WD组与Control组之间,TB组与TD组之间均未见明显变化(P0.05)。7免疫组化:α-SMA:与Control组比较,WD组α-SMA表达量增高(P0.05);布拉氏酵母菌干预后,TB组及TD组未见明显变化(P0.05);TNF-α:与Control组比较,WD组表达量增高(P0.05),同TD组比较,TB组表达下降(P0.05)。8 16s r RNA宏基因组测序:布拉氏酵母菌干预后TB组较TD组增多的有:厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和放线菌门(Actinobacteria),差异有统计学意义(P0.05),TB组较TD组减少的有:拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria),差异有统计学意义(P0.05),含量较多的前15种菌群中其余菌群未见明显统计学差异(P0.05)。结论:1通过采用经典的西方饮食,成功建立了NAFLD小鼠模型。2布拉氏酵母菌可能通过调节肠道菌群发挥对NAFLD的治疗作用。3布拉氏酵母菌可能通过下调肝脏淋巴细胞内CD4+/CD8+比值在NAFLD中发挥治疗作用。4布拉氏酵母菌可能通过下调肝脏淋巴细胞内CD4+T RORγt的表达在NAFLD中发挥治疗作用。5布拉氏酵母菌可能通过抑制内毒素、TNF-α、IL-17的表达在NAFLD中发挥治疗作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.5

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本文编号：1303307