乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活及其与TLR9关系的研究

发布时间：2017-12-21 20:15

  本文关键词：乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活及其与TLR9关系的研究　出处：《第二军医大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：肝细胞肝癌是全球发病率排前十、致死率排第二的恶性肿瘤。在我国,60%肝癌患者是由慢性乙型肝炎发展而来,称为乙肝相关肝细胞癌。乙肝相关肝细胞癌患者体内存在两种状态,即恶性肿瘤状态和乙型肝炎病毒感染状态。针对肝细胞癌,目前公认的治疗措施有肝切除、肝移植、肝动脉化疗栓塞和局部消融等。乙肝相关肝细胞癌患者在接受抗肿瘤治疗过程中会出现病毒激活,病毒激活引起的机体免疫损伤会加重肝脏的炎症反应,加快肝硬化进程,进而使患者失去抗肿瘤治疗的肝功能基础,甚至使治疗中断,最终影响患者的预后。Toll样受体9(TLR9)是一类介导天然免疫反应的跨膜信号传递受体,是模式识别受体家族中的一员,高表达于浆细胞样树突状细胞和B细胞上,弱表达于肝细胞、枯否细胞、间质细胞和肿瘤细胞表面。乙型肝炎病毒是一种嗜肝性、非致细胞病变的DNA病毒,主要与浆细胞样树突状细胞表面的TLR9结合,激活依赖髓样分化因子(MyD88)信号通路,启动机体免疫反应。已有研究证实树突状细胞及TLR9信号通路分子障碍会引起病毒持续性感染,同时激活TLR9信号通路相关分子可以在一定程度上抑制病毒复制。但目前关于TLR9在病毒激活中的作用尚无相关报道。因此分析乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活的危险因素,并深入探讨TLR9与病毒激活的关系,能够为寻找抗病毒激活治疗新靶点提供理论依据。本课题是以乙肝相关肝细胞癌患者为对象开展的临床与基础相结合的研究,共纳入了2015年3月至2015年12月于我科行手术治疗的34例乙肝相关肝细胞癌患者。第一部分收集患者临床资料,并进行随访,分析乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活的临床危险因素;第二部分收集了患者术前和术后外周血,分离浆细胞样树突状细胞和外周血血浆,探讨TLR9信号通路分子(TLR9、MyD88、IRAK1、TRAF6、TAK1、IRF7)mRNA表达水平、细胞因子(IFN-α、IL-6、IL-12、TNF-α)分泌量与病毒激活的关系;第三部分收集了入组患者手术切除标本(肿瘤组织和癌旁组织),研究组织中TLR9分子是否也参与了病毒激活过程,并探讨其发挥作用的下游分子。第一部分:收集患者临床数据,如人口学信息(性别、年龄)、肝炎背景、血常规(白细胞计数、血小板计数)、肝功能(总胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、白蛋白、前白蛋白)、肾功能(肌酐、尿素氮)、肿瘤指标(甲胎蛋白)、乙肝两对半、术前术后HBV DNA载量以及一些其他相关指标如肿瘤部位、肿瘤大小、癌栓、子灶、术中肝门阻断时间、出血量等。术后随访患者HBV DNA载量及临床指标变化,后按病毒激活标准将患者分为激活组和未激活组。其中激活组10例,未激活组24例。采用SPSS 20.0(Chicago,IL,United States)软件对乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活进行单因素和多因素非条件logistic回归分析。单因素分析提示:1)术前丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶明显升高者(100u/l)术后病毒激活发生率显著高于术前转氨酶正常者(100.0%vs20.0%,p=0.001)。2)术前长期行抗病毒治疗的患者术后病毒激活发生率明显低于未行抗病毒治疗者(56.3%vs5.6%,p=0.001)。3)术后第七天天门冬氨酸氨基转移酶仍然较高者(100u/l)病毒激活率显著高于术后转氨酶正常者(66.7%vs21.4%,p=0.027)。多因素logistic回归分析提示:术前未长期行抗病毒治疗是乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活的独立危险因素(hr=13.908;95%ci,1.137—170.067,p=0.039)。第二部分:为进一步从免疫学和分子生物学基础上分析乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活机制,本课题收集了患者术前和术后第七天的外周血,分离浆细胞样树突状细胞,定量检测tlr9信号通路分子(tlr9、myd88、irak1、traf6、tak1、irf7)mrna表达水平,并采用酶联免疫试剂盒(elisa)检测血浆中细胞因子(ifn-α、il-6、il-12、tnf-α)含量。最后采用统计学方法比较两组患者术前术后上述分子及细胞因子表达差异。结果提示:1)病毒激活与患者术前和术后外周血中树突状细胞数目无明显相关性。2)激活组患者术前和术后tlr9信号通路相关分子(tlr9、myd88、irak1、traf6、tak1、irf7)mrna相对表达水平均较未激活组减少。统计学分析提示:激活组术前myd88mrna含量较未激活组减少(0.39,0.26-2.59vs1.03,0.64-2.62,p=0.042);激活组术前irf7mrna相对表达量为(0.67,0.28-1.00),未激活组为(2.42,1.19-5.46)(p=0.008);激活组术后tlr9mrna相对表达量为(0.27,0.12-0.32)较未激活组(0.63,0.28-1.09)明显减少(p=0.009);术后traf6mrna相对表达量为(0.69,0.49-0.98)显著低于未激活组(1.02,0.80-1.79)(p=0.025);术后tak1mrna激活组相对表达量为(0.22,0.14-0.62)低于未激活组为(0.54,0.29-1.04)(p=0.038);术后irf7mrna激活组表达量为(0.26,0.18-0.52)较未激活组(0.66,0.32-1.02)明显减少(p=0.020)。3)elisa检测提示激活组患者术后外周血浆中肿瘤坏死因子(tnf-α)分泌量较未激活组显著减少(11.44±2.04pg/mlvs14.78±3.55pg/ml,p=0.002)。第三部分:收集患者术中肿瘤组织和癌旁组织,抽提rna和蛋白,通过定量pcr、免疫组化和蛋白免疫印迹等方法分析tlr9、myd88、irak1、traf6、tak1、irf7分子表达差异与病毒激活的关系。结果显示:1)激活组和未激活组患者肿瘤组织中上述分子mrna表达水平无明显差异。2)激活组患者癌旁组织中tlr9mrna表达较未激活组明显增多(6.35,4.43-14.17vs0.66,0.28-1.64,p=0.006),且蛋白免疫印迹提示tlr9蛋白水平表达也较未激活组显著增多。但激活组和未激活组癌旁组织中myd88、irak1、traf6、tak1、irf7分子转录水平及蛋白水平表达无明显差异。本课题可以得出以下结论:1)术前未长期行抗病毒治疗是乙肝相关肝细胞癌患者术后病毒激活的独立危险因素,提示临床上积极抗病毒治疗可能可以降低术后病毒激活发生率。2)病毒激活与浆细胞样树突状细胞数目无关,提示其可能与细胞功能障碍有关。3)激活组患者TLR9在外周血浆细胞样树突状细胞上呈低表达而在癌旁组织中高表达,提示TLR9在乙肝相关肝细胞患者术后病毒激活中可能起着“双刃剑”作用:树突状细胞等免疫细胞上表达的TLR9可以调节机体固有免疫及适应性免疫,促进细胞因子的释放;癌旁组织上表达的TLR9能够帮助乙肝病毒逃避宿主监视,躲避术前病毒清除从而引起病毒激活。4)乙肝相关肝细胞癌患者术后TNF-α分泌减少可能是病毒激活的机制之一。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62;R735.7

【参考文献】

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本文编号：1317034