以支架为载体的TRADD基因慢病毒转染对食管良性狭窄的抑制作用

发布时间：2018-01-11 02:29

本文关键词：以支架为载体的TRADD基因慢病毒转染对食管良性狭窄的抑制作用　出处：《第三军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景食管良性狭窄引起的吞咽困难临床较难解决,严重影响患者生活质量,并且引起严重并发症。其治疗常采用探条扩张或球囊扩张,但其复发率较高。目前对难治性良性食管狭窄治疗主要是安装食管支架。食管支架可显著改善患者吞咽困难等症状。但是各食管支架仍有缺点:自扩张金属支架(self-expandable metal stents,SEMS)两端因金属成分对食管黏膜的刺激作用,常导致肉芽组织增生而引起再狭窄,肉芽组织常将支架包埋,当要移除金属支架时,可导致食管破裂。自扩张塑料支架(self-expandable plastic stents,SEPS)能减少反应性组织增生及增强支架移除安全性,但是其具有较高的支架移位率(62%)及缓解吞咽困难的时间较短]。可吸收支架(biodegrdable stents BDS)允许支架被组织包埋及不需要取出,但是其在食管内一般只能发挥作用6周,不能有效支撑到8-12周以上,再狭窄发生率仍较高。因此,目前对难治性良性食管狭窄还缺乏满意的治疗手段]。食管良性狭窄主要是由于增生性瘢痕引起。目前的研究显示,细胞凋亡与瘢痕增生、瘢痕疙瘩的形成密切相关。细胞凋亡表现为凋亡信号通路的基因表达,其最主要的传导途径为死亡受体(Death-receptor,DR)介导的信号转导。目前已研究的死亡受体包括TNFR1,FAS,DR3,DR4,DR5,DR6,NGFR和EDAR,其中研究最彻底的是TNFR1,其与配体,即肿瘤坏死因子死亡受体相关死亡域蛋白(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Death Domain Protein,TRADD)结合,通过肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)介导的信号通路调控细胞的凋亡过程。在瘢痕组织中,因为TRADD的表达较低,从而抑制了肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡途径,进而导致了增生性瘢痕成纤维细胞(Hypertrophic Scar Fibroblast,HSFB)的增殖失去调控而过度增殖,从而导致病理性瘢痕的形成。我们前期使用慢病毒载体系统成功构建了人TRADD基因过表达慢病毒,将其转染入HSFb后,该重组病毒可恢复HSFb中TRADD蛋白正常表达,抑制HSFb细胞增殖,影响细胞分裂,促进细胞凋亡,降低I型胶原蛋白的分泌,从而减少hs的形成。因此,我们拟以氩离子凝固术构建实验犬食管狭窄模型,以全覆膜食管支架作为载体,将tradd基因慢病毒转染入食管狭窄段组织,观察其抑制组织增生及防止再狭窄的效果。目的本实验观察tradd基因慢病毒涂层食管支架置入后,tradd基因对犬食管良性狭窄粘膜的转染效果及对食管狭窄的抑制作用。方法1、将15只实验犬随机平均分为实验组、对照组及空白组,采用氩离子凝固器制作良性食管狭窄模型,分别置入gfp-tradd基因慢病毒涂层带膜食管支架、gfp-慢病毒涂层食管支架、普通带膜食管支架,1周后观察支架脱落情况,并取出支架,2、3、4周胃镜下观察狭窄程度。2、4周后处死实验犬,对狭窄食管组织行病理、masson三色染色法、免疫荧光检查。3、分别采用western-blot方法检测tradd蛋白在三组食管组织中的表达,同时检测collagenⅠ、collagenⅢ、α-sma三种蛋白在食管组织中表达情况。结果1、置入食管支架1周后,胃镜检查见实验组实验犬带膜支架全部移位进入胃,对照组和空白组实验犬分别有2只、3只实验犬其带膜支架移位进入胃中,胃镜取出所有实验犬未移位食管支架。此后每周测量其食管狭窄处直径,可见对照组及空白组实验犬再次出现食管明显狭窄,而实验组再狭窄较轻。采用重复测量设计的多因素方差分析,p〈0.01,具有统计学意义。2、食管狭窄组织he染色切片表明空白组和对照组的肉芽组织及纤维组织增生,而实验组肉芽组织及纤维组织增生较不明显。masson三色染色法显示实验组中,胶原纤维含量较空白组、对照组减少。免疫荧光镜检查可见实验组及对照组的实验犬食管瘢痕中绿色荧光蛋白在黏膜下组织中有表达,表明tradd基因慢病毒及慢病毒均在食管黏膜下生长。3、western-blot检测到实验组gfp-tradd-flag蛋白,而空白组和对照组未检测出该蛋白,表明tradd基因慢病毒成功转染至食管黏膜下组织。western-blot显示实验组collagenⅠ、collagenⅢ、α-SMA三种蛋白较其他两组显著降低,具有统计学差异。结论以支架作为载体可成功将TRADD慢病毒转入食管粘膜组织中,可抑制狭窄部位组织增生,减少食管狭窄部位再狭窄发生。
[Abstract]:It is difficult to solve the difficulty of swallowing difficulty caused by benign esophageal stenosis , which seriously affects the quality of life of patients and causes serious complications . Objective To investigate the effect of tradd gene on the expression of TRADD protein in esophageal tissues and to observe the effect of tradd gene on esophageal stricture .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R571

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