非经典Wnt信号通路在小鼠肝干细胞干性、增殖和终末分化中对经典Wnt信号通路的调控作用

发布时间：2018-02-09 01:39

  本文关键词： 肝再生 肝脏干细胞 Wnt/β-catenin信号通路 非经典Wnt信号通路　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:肝脏在生物体内具有重要的代谢、外分泌和内分泌等多重功能,肝脏的生理功能异常可以导致其高死亡率。肝脏是高度再生的器官,在损伤期间可依赖所含干细胞被激活,通过自我复制完全恢复功能。经典的Wnt/β-catenin信号在肝再生发育过程中,参与调节胎肝细胞的增殖和分化。但是,可能的非经典Wnt信号通路在这个过程中所起作用尚不清楚。目的:探讨非经典Wnt信号在经典Wnt信号通路参与的小鼠肝脏发育中,对胎肝细胞的增殖,干性及终末分化所起的作用。方法:首先我们在不同发育阶段(出生后0D,14D,28D,180D)的小鼠肝脏组织中,运用Real-time PCR检测已知的所有经典和非经典Wnt信号通路各组份的表达量。然后以可逆性永生化小鼠胎肝细胞系i HPx为实验对象,Real-time PCR检测Wnt信号通路各组分的表达情况。构建重组腺病毒过表达经典Wnt 1,2,3,3a,6,7a。β-catenin/TCF4/LEF萤光素酶活性报告基因TOP-luc用于检测经典Wnt1,2,3,3a,6,7a在i HPx细胞中对经典通路下游的激活情况。构建重组腺病毒过表达非经典Wnt 5a,9b,10a,10b,利用TOP-luc检测非经典Wnt5a,9b,10a,10b在i HPx细胞中与经典Wnt信号通路的作用。Real-time PCR检测非经典Wnt5a,9b,10a,10b刺激i HPx后,经典Wnt信号通路下游基因表达量的变化,以及小鼠肝干性标志物、终末成熟分化标志物和肝脏分化特异性标志物的表达量变化。WST-1实验检测不同Wnt对i HPx细胞增殖的影响。白蛋白报告基因Alb-reporter检测不同Wnt对i HPx细胞成熟分化的影响。考虑到i HPx细胞内永生化基因SV40T对实验结果的影响,利用重组腺病毒Ad Cre,对SV40T基因进行敲除,Real-time PCR检测刺激在SV40T敲除i HPx细胞中,过表达非经典Wnt5a,9b,10a,10b后,小鼠肝脏干性标志物、终末成熟分化标志物和肝脏分化特异性标志物的表达量变化。吲哚菁绿摄取实验(ICG)与过碘酸-希夫式反应/糖元储存实验(PAS)检测胎肝细胞在过表达Wnt3a,5a,9b,10a,10b以后的分化成熟程度。在i HPx细胞中过表达Wnt3a,5a,9b,10a,10b后,行裸鼠皮下异位瘤实验,对皮下包块行切片后HE染色及免疫组化,观察不同Wnt对i HPx细胞增殖及分化的影响,已经对经典通路关键因子β-catenin表达量的影响。结果:1.Real-time PCR结果显示在小鼠不同发育阶段(出生后0D,14D,28D,180D)的肝组织中,经典Wnt蛋白除Wnt7a外,均可被检测,晚期尤甚。非经典Wnt蛋白Wnt9b,10a,10b表达显著增高,与时间成正相关,在出生后28D达到顶峰。各受体、联合受体、受体拮抗剂、信号通路相关因子表达量与时间关系也各不相同。在去或不去SV40T的i HPx细胞中(GFP为对照组),相较于其它Wnt,非经典Wnt5a,9b,10a,10b以及经典Wnt3a依旧显著高表达,其余信号通路各组分表达与小鼠肝组织中的表达量情况大致相似。此部分结果提示,在小鼠肝发育过程中,除经典Wnt信号通路外,高表达的非经典Wnt5a,9b,10a,10b也可能参与其中。2.在i HPx细胞内分别过表达所有经典Wnt1,2,3,3a,6,7a,利用萤光素酶活性报告基因TOP-luc对的β-catenin/TCF4/LEF的活性检测进行检测,结果显示经典Wnt均可以激活i HPx细胞内的β-catenin/TCF4/LEF通路。挑选Wnt3a作为经典Wnt代表在i HPx细胞内过表达以后,联合分别过表达非经典Wnt5a,9b,10a,10b,β-catenin/TCF4/LEF的活性被抑制。在i HPx细胞内过表达Wnt5a,9b,10a,10b以后,Real-time PCR检测经典Wnt信号通路下游靶基因Axin2,Sox9d等的表达被抑制。以上结果提示:非经典Wnt5a,Wnt9b,Wnt10a和Wnt10b蛋白在小鼠肝发育过程中,具有微调经典Wnt蛋白抑制β-catenin/TCF4/LEF活性的作用。3.在i HPx细胞过表达Wnt3a,5a,9b,10a和10b以后,与GFP对照组相比,WST-1结果表明Wnt3a在不同时间点可促进i HPx细胞的增殖,而Wnt5a,9b,10a和10b抑制i HPx细胞的增殖。Real-time PCR结果提示在过表达非经典Wnt5a,9b,10a,10b以后,i HPx细胞内大部分干性相关基因被抑制,肝脏成熟相关基因表达增高。在含有白蛋白萤光素酶报告基因的i HPx-Alb reporter-luc细胞系内,过表达Wnt5a,9b,10a和10b以后,白蛋白的表达量亦增加。ICG和PAS实验结果提示过表达Wnt3a后,与GFP对照组相比无明显差异,而过表达Wnt5a,9b,10a和10b后,与GFP对照组相比i HPx细胞摄取吲哚菁绿和储存糖原的能力增强。该部分结果提示:经典Wnt3a可以促进i HPx细胞的增殖,而Wnt5a,Wnt9b,Wnt10a和Wnt10b可抑制细胞增殖,同时促进i HPx细胞的成熟分化。4.在去除SV40T的去永生化i HPx细胞中,Real-time PCR结果提示SV40T促进干性相关基因的表达,抑制成熟肝相关基因的表达。在去除SV40T的i HPx细胞中过表达Wnt5a,9b,10a,10b后,Real-time PCR结果提示i HPx细胞干性相关基因被抑制,成熟肝相关基因高表达。去除SV40T的i HPx细胞内过表达不同Wnt,ICG实验与PAS实验结果与前一致。该部分结果提示:永生化基因SV40T可维持i HPx细胞干性,抑制其成熟分化,去或不去永生化后的i HPx细胞,不同Wnt信号对其作用并无明显差异。5.在不同Wnt刺激的i HPx细胞裸鼠皮下成瘤试验中,HE染色结果提示,过表达Wnt3a实验组的i HPx细胞,细胞核大深染,细胞质少且淡然,细胞生长状态较5a,9b,10a,10b组旺盛。免疫组化结果提示,Wnt3a实验组PCNA阳性着色显著高于GFP实验组,而Wnt5a,9b,10a,10b实验组阳性着色低于GFP组。β-catenin阳性着色在Wnt3a组显著高于GFP对照组,而Wnt5a,9b,10a,10b实验组的阳性着色低于GFP对照组,提示经典Wnt3a激活β-catenin,而经典Wnt5a,9b,10a,10b抑制β-catenin活性。该部分实验结果提示,在体内过表达Wnt3a可激活经典β-catenin通路刺激i HPx细胞的增殖,而Wnt5a,9b,10a,10b抑制经典β-catenin通路抑制i HPx细胞的增殖综上所述,非经典Wnt蛋白5a,9b,10a,10b在经典Wnt3a参与的调节小鼠肝发育过程中,抑制肝干细胞的增殖与干性,促进肝干细胞的终末分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575

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本文编号：1496770