Caveolin-1在急慢性酒精性肝损伤中的作用机制和中药靶标治疗研究
发布时间：2018-02-13 22:41
本文关键词： Caveolin-1 酒精性肝损伤 狂饮 诱导型一氧化氮复合酶 ONOO~- 出处：《南方医科大学》2014年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：研究背景酗酒在全世界范围内作为一种习惯而普遍存在,其影响和危害目前已被公认。酗酒已经成为全球范围内疾病和残疾的第三大诱因,导致最常见的症状是慢性酒精中毒,其可能诱发多达60多种疾病,不仅对个人的身体健康有很大影响,同时亦造成严重的社会后果。狂欢性饮酒作为普遍流行于男性年轻人群体中的一种特殊的饮酒模式,同长期慢性饮酒模式共同参与了多数酒精性肝病的发生发展过程中,但其作用机制仍有待深入。酒精通过激活氧化应激反应诱导氧族与氮族自由基增多,是酒精性肝细胞损伤的重要作用机制之一。这一过程中大量产生的自由基:超氧阴离子(02-)、过氧化氢(H202)、羟自由基CO(OH-)、一氧化氮(NO)和乙氧自由基(C2H50-)等,不仅激活磷脂酶及脂质过氧化反应,还影响遗传物质和蛋白质的结构及功能造成肝细胞损伤。此外,NO对线粒体呼吸的抑制作用对肝脏代谢具有重要影响。NO和O2-结合产生的过氧亚硝酸基阴离子(ONOO-),是一种强氧化剂和细胞毒性物质,能够直接引起细胞的损伤与凋亡。研究表明NO主要是通过三种一氧化氮复合酶(eNOS、nNOS和iNOS)诱导产生,而NOS的生物结构中存在Caveolin-1(Cav-1)结合基序(OXOXXXXO,or OXXOXXXXO),能够被 Cav-1 的脚手架结构蛋白(Caveolin-scaffolding domain,CSD)结合。Cav-1作为NOS的重要调控蛋白,在氮自由基损伤的发生发展过程中起到重要作用。Cav-1,是小窝膜上重要的一个结构蛋白(21-24 KD),调节细胞生长、细胞凋亡和胆固醇转运等生理功能。它可以通过与NOS直接结合的方式调节三种类型的NOS。研究表明,Cav-1基因敲除小鼠的心脏中eNOS和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平均显著性上调。我们的研究团队先前已报道在神经细胞中Cav-1和NO之间的负相关调控机制。目前,关于Cav-1在其他肝脏疾病中有一定的研究,但是在酒精性肝损伤,特别是由不同的饮酒习惯所导致的损伤发生发展的机制中,Cav-1的病理生理作用仍有待深入探究。现代新药的发现竞争的焦点在于靶点的发现与证实以及供筛选的库,传统中药由于拥有几千年长期临床经验的积累,在新药的研究中拥有广阔的前景,如何在庞大的中药资源中筛选出有针对性和特异性的中药成分,并结合生物靶点的研究基础去探究中药靶标治疗的理念,或许能促进中医药理论的进一步深化,并为中医药在全球的进一步推广提供科研依据。在这项研究中我们通过体内动物实验(基因敲除小鼠)、体外细胞实验以及人体临床实验深入探索了 Cav-1在急慢性饮酒引起的肝损伤发生发展的作用机制。为Cav-1在狂饮过程中以及长期慢性饮酒诱导肝损伤中的作用提供了理论基础和临床依据。同时我们尝试筛选出针对Cav-1调控的特异性中药单体,为中药靶标治疗理念在酒精性肝损伤的治疗和运用提供分子生物实验依据。研究方法:1.动物实验本课题中动物实验方案由香港大学动物伦理中心批准。同窝对照的雄性Cav-1 基因敲除小鼠(Cav-1~(-/-)mice,strain Cav-1tmlMls/J,Jackson Laboratory,USA),Cav-1基因杂合子小鼠(Cav-1~(+/-))以及野生型正常小鼠(WT,Cav-1+/+)鉴定后在8-12周龄被用于模型建立。1.1.急性狂欢性饮酒动物模型建立狂欢性饮酒(Binge drinking,狂饮或豪饮)模型:小鼠禁食不禁水6h后,用50%(vol/vol)酒精按照饮酒总量5g/kg体重的剂量灌胃。对照组以等体积的水溶液灌胃。平行干预实验中,在狂饮模型建立的30分钟前给予小鼠iNOS抑制剂 N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidine(1400W;5 mg/kg,ip.)。1.2.慢性酒精性肝损伤动物模型建立将6-8周的雄性野生型及Cav-1~(-/-)小鼠喂养Lieber-deCarli液体词料,3天后随机分为四组:野生型小鼠对照液态饲料喂养组和酒精液态词料喂养组;Cav-1~(-/-)小鼠对照液态饲料喂养组和酒精液态词料喂养组。酒精组小鼠喂养梯度浓度的酒精,1%和2%(vol/vol)各自喂养2天,3%喂养3天,而后5%酒精喂养7周。对照组全程喂养等卡路里液体词料。1.3.慢性酒精性肝损伤动物模型柚皮苷处理组小鼠慢性酒精性肝损伤模型建立第3周后开始以200mg/kg/d的剂量对小鼠流质饮食中添加柚皮苷,持续4周。1.4.实验动物样品制备各组小鼠模型完成后,用200mg/kg戊巴比妥麻醉小鼠,经心脏采血,分离血清,-80℃保存备用,用于检测血清Cav-1水平、谷丙转氨酶和谷草转氨酶(ALT/AST)、NO水平、NOS 水平(总复合酶活性及iNOS活性)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(Catalase)活性、谷胱甘肽(GSH)活性及表达、游离脂肪酸(Free fatty acids,FFA)及甘油三酯(Triglycerides,TC)水平。然后通过心脏灌注将小鼠体内的血液排除,取出小鼠肝脏,观察其大体形态,并于肝左叶中部取新鲜肝组织4%PFA固定后行病理切片处理(冰冻切片和石蜡切片),HE染色及各种免疫组化检测,观察肝脏组织病理学变化,同时检测肝组织中Cav-1及相关蛋白的表达,以及用TUNEL检测肝细胞凋亡情况;同时取相邻部位肝组织肝组织匀浆,用于免疫印迹实验(Western blot),检测肝组织中Cav-1及相关蛋白的表达改变,同时检测肝脏中一氧化氮复合酶水平、ADH、Catalase、GSH及SOD活性;另取一部分肝组织液氮速冻后保存,以提取小鼠肝脏总RNA,用于逆转录-聚合酶链反应及Real-time PCR反应检测Cav-1、炎症因子的mRNA水平。1.5.ONOCT荧光探针实验COMPOUND 14(专利号:WO2013113279A1),是由香港大学化学系最新研制成功的一种针对ONOO-特异性结合的红色荧光探针,具有极其强烈的探测ONOO-敏感性及选择性。小鼠狂饮模型建立后3h,对麻醉后的狂饮小鼠肝脏进行 ONOO-探针溶液 COMPOUND 14(1 mM/mice liver;Perfusion rate:2 ml/min,total25 ml)的灌注后,急速冷冻做成冰冻切片,荧光显微镜下观察并记录。2.细胞实验人源正常肝细胞株L02购自中山大学动物实验中心细胞库。常规培养传代后,建立酒精性损伤细胞模型。用100mM、200mM酒精处理L02细胞24小时后,提取细胞蛋白,Western blot检测在酒精干预下肝细胞Cav-1表达的时间及浓度效应;使用ERK1/2抑制剂PD98059以及STAT3抑制剂SD-1029分别干预L02细胞,24小时后观察Cav-1的改变情况;用Cav-1小分子干扰RNA(siRNA)转染L02细胞诱导Cav-1的沉默,观察Cav-1相关蛋白的改变情况。3.人体临床试验本临床试验采用随机、平行、对照试验设计,共有65名年龄为21-35岁健康无长期饮酒史的健康男性受试者。为达到狂饮(Binge drinking)模型的要求,饮酒组需要在2h内饮用5个标准杯的白酒(一个标准杯相当于14g酒精),对照组2h内饮用同等体积的水溶液。本临床试验通过了南方医科大学中西医结合伦理委员会的批准,批准编号[2013]伦理字(001)号,并在中国临床试验注册中心Chinese Clinical Trial Registry注册并审gü，
本文编号：1509268
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