血管舒缓素对重症急性胰腺炎合并缺血再灌注损伤大鼠胰腺微循环影响的研究

发布时间：2018-03-04 07:28

本文选题：血管舒缓素　切入点：重症急性胰腺炎　出处：《河北医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:重症急性胰腺炎(SAP)是临床中较为凶险的急症,致死率较高。多种因素造成对胰腺组织的打击,诱发多种炎症介质的瀑布样级联反应和细胞因子应激紊乱,导致全身炎性反应综合征(SIRS),随之打破与之拮抗的代偿性反应综合症(CARS)的平衡,并直接引起多器官功能衰竭(MODS)。胰腺炎发病的共同通路是胰腺缺血再灌注损伤(IRI),尤其是在从急性水肿型胰腺炎(AP)即轻型胰腺炎,向重症急性胰腺炎演变过程中起到至关重要的作用,具体表现为胰腺微血流降低、微血管通透性增加、血液流变学的变化及胰腺组织炎细胞的浸润等。预防和改善SAP合并IRI,对减轻胰腺组织坏死,阻止SIRS及MODS有重要意义。血管舒缓素(PK)作为一种活化因子,由18种氨基酸和4种糖所组成,其在人体内逐渐降解激肽原释放出大量激肽,激肽又对微血管和毛细血管起作用,促使二者扩张,同时扩大了血管网之间的交汇,对微血管的通透性有明显改善作用,并增加血流量;同时可以抑制血管紧张素之间的转化,减轻小血管收缩作用;通过改善凝血时间及抑制钙离子,引起毛细血管内皮细胞PGI2的生成减少,减少血小板的聚集,尚可以使纤溶酶原激活成纤溶酶,降低纤维蛋白含量,预防微血管血栓形成;并能调控机体的炎症反应过程。本实验以雄性Wistar大鼠为研究对象,采用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注入结合脾动脉30分钟夹闭的方法,建立SAP合并IRI模型;并通过经大鼠尾静脉泵入PK的方法进行药物干预。应用CHEMIX-800全自动生化分析仪测定大鼠血清AMY/LIP;以ELISA法测定大鼠血清TNF-a/IL-1β表达水平;大鼠血浆内毒素水平以鲎试剂基质偶氮显色法检测;并通过胰腺组织肉眼观察及使用光学显微镜进行胰腺病理评分;从四个方面检测PK对SAP合并IRI大鼠病情的影响。胰腺微循环血流以Preflux4001双通道激光多普勒血流仪进行测定;胰腺微血管通透性通过伊文氏蓝方法进行测定;血液流变学改变以血液流变仪进行测定;以流式细胞仪测定粘附因子CD18、CD54的水平;从以上四个方面探讨PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微循环影响的作用机制。方法:1实验动物雄性Wistar大鼠,3-4月龄,体重300-350g,清洁级,北京隆安实验动物养殖中心提供,自由饮水及进食。2动物分组实验第一部分:60只大鼠随机分为两大组,每大组30只。每大组大鼠再随机分为3小组,每组10只,分别为假手术组、SAP合并IRI组,SAP合并IRI且PK干预组,所有大鼠均造模并给药后12小时处死进行检测。第一组大鼠造模12小时后开腹,经腹主动脉采血5毫升,平均分为两等份,一份检测血清AMY/LIP;另一份检测大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达水平。第二组大鼠于造模12h后开腹,肉眼观察胰腺组织大体变化;再经腹主动脉采血5毫升,检测血浆内毒素水平;最后处死大鼠,取100毫克胰腺组织,浸泡于10%福尔马林,取出后包埋蜡块,切成4um薄片,附于玻片并HE染色,进行胰腺病理学评分。实验第二、三、四、五部分:每一个实验部分大鼠各30只,随机各分为三组,每组大鼠10只,分别为假手术组、SAP合并IRI组,SAP合并IRI且PK干预组,所有大鼠均造模并给药后12小时处死,分别检测大鼠胰腺微循环血流;胰腺微血管通透性;血液流变学;白细胞粘附因子CD18、血管内皮细胞粘附因子CD54表达水平。3实验模型的建立3.1 SAP合并IRI模型建立:采用改进的Aho等的SAP造模方法,首先腹腔内注射3%戊巴比妥钠30mg/kg,麻醉成功后将大鼠固定于手术板,剪去腹部毛发,常规消毒铺巾。取上腹正中切口3cm逐层入腹,首先确认十二指肠位置,片状胰腺组织在其内侧,打开十二指肠前壁并找到胰胆管。小号动脉夹夹住肝十二指肠韧带肝门侧以阻断胆管,于胰胆管开口处以24G针头予以穿刺,针头进入胰胆管0.5cm后缝扎针头予以固定,将针头连接微量输液泵,经胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠,剂量0.1ml/kg,速度0.2ml/min。大约5-10min后胰腺组织充血水肿,压迫穿刺点后缝合十二指肠前壁。参考Fujimoto等的IRI造模方法,SAP模型建立后,动脉夹立即夹闭脾动脉30min再松开,胰腺组织局部缺血,腹腔脏器复位后临时关腹。大鼠造模前12小时禁食、4小时禁水,模型建立后立即背部皮下注入生理盐水5毫升,允许自由饮水并注意保暖。3.2 SAP合并IRI且PK干预组模型建立:SAP合并IRI大鼠模型建立后,将大鼠四肢固定于木质托盘上,40-45度温水浸泡尾静脉半分钟,使其血管充血,擦干备用。选择5号注射针头,以30度角距尾尖2厘米进针,平行向前,见回血时立即参考药物使用说明书给药。PK按2U/只,溶于NS 5ml,尾静脉持续泵入注药,连续12小时。3.3假手术组模型建立:以SAP模型建立的方法操作,不同的是逆行胰胆管注入同等剂量的生理盐水,且物理翻动胰腺组织,动作重复3次,余条件相同。实验动物均符合医学伦理学管理标准。4 PK对SAP合并IRI大鼠病情变化指标影响的检测4.1 PK对SAP合并IRI大鼠血清AMY/LIP的检测大鼠血清AMY/LIP检测采用全自动生化检:第一组大鼠造模后12h开腹,经腹主动脉采血5毫升,平均分为两等份,取一份血液标本置入密封的采血管中静置1小时,离心10分钟(3000r/min),血清AMY/LIP以CHEMIX-800全自动生化分析仪进行测定。4.2 PK对SAP合并IRI大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达的检测大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达通过ELISA法检测:取第一组大鼠另一份血液标本,置入密封采血管后静置1小时,离心10分钟(3000r/min),取血清放入-20℃冰箱中保存,待行ELISA检测,TNF-a/IL-1β水平检测方法严格按试剂盒操作说明书的要求进行。4.3 PK对SAP合并IRI大鼠血浆内毒素水平的检测大鼠血浆内毒素以鲎试剂基质偶氮显色法进行检测:第二组大鼠造模后12小时常规开腹,首先观察胰腺大体变化,后经腹主动脉采血5毫升,按照鲎试剂盒说明书要求,首先对试验器材进行去热源处理,留取标准血样并配置试剂,吸管吸取血清0.1毫升,与0.05毫升鲎试剂均匀混合,放置于37℃水浴箱3分钟,之后取出,并加入0.5毫升亚硝酸钠混匀,随后再加入0.5毫升氨基磺酸氨,最后加入0.5毫升奈乙二胺均匀混合,随后波长545纳米以723分光光度计进行比色读数。计算公式:A=As-(Ab-Abb),求得吸光度A值后,查对内毒素标准曲线并求得内毒素的含量。4.4 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺病理评分的评估大鼠胰腺病理评分采用光学显微镜法:第二组大鼠抽血检测血清内毒素前,首先观察胰腺组织大体变化;后取100毫克胰腺组织,浸泡于10%福尔马林,取出后包埋成蜡块并切成4微米薄片,附于玻片HE染色,在光学显微镜下观察,参考Grewal的方法并加以改进,从四个方面即水肿、出血、坏死、炎性浸润等评分,每项指标分别为0、1、2、3、4五个分值,最后汇总并计算总分。5 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微循环血流影响的检测:各组大鼠于造模给药后12h常规开腹,用Preflux 4001双通道激光多普勒血流仪测定胰腺微循环血流各项指标,探头口径0.25mm,波长780nm。探头轻轻接触胰腺组织表面,首先分别测定胰头、胰尾处血流,之后选取胰头-胰尾测量连线中点的胰体处进行测定,避开血肿组织及胰腺大血管,取算术平均值为最终结果。具体检测指标包括胰腺微血管血流量、血流速度,微动脉、微静脉管径,毛细血管管径、密度、灌注等指标。6 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微血管通透性影响的检测:采用改进的Keiji等方法进行检测,各组大鼠检测胰腺微循环血流之后,从股静脉注入1%伊文氏兰,剂量2ml/kg,胰腺组织30分钟后取出,称湿重后,取150毫克组织置入5毫升试管,按照0.03/mg加入甲酰胺。24h后取浸出液1毫升,通过分光光度计检测伊文氏兰的浓度,伊文氏兰的漏出量依次计算;剩余胰腺组织剪碎,置于160度的电热干燥箱内,24小时后予以称重,以湿/干重之比计算150mg胰腺组织干重;微血管通透性最后以伊文氏兰漏出量/胰腺组织干重(ug/g)表示。7 PK对SAP合并IRI大鼠血液流变学影响的检测:采用BV-100血流变仪检测大鼠血液流变学。各组大鼠模型建立后12小时常规开腹,经腹主动脉采血5毫升置入不凝管,均匀摇晃,置BV-100血流变测试仪送检。检测指标包括全血高、中、低切边率下、血浆粘度、全血还原粘度;红细胞聚集指数、血沉及血沉方程K值;红细胞变形指数及红细胞刚性指数;红细胞压积,纤维蛋白原。8 PK对SAP合并IRI大鼠白细胞粘附因子CD18、血管内皮细胞粘附因子CD54表达水平影响的检测:粘附因子CD18、CD54检测采用流式细胞仪法。各组大鼠模型建立后12小时常规开腹,经腹主动脉采血5毫升,EDTA抗凝,取100微升离心10分钟,1500r/min;取3支管标记A、B、C。A管加入20ul CD45-per CP、20ul CD18-FITC,B管加入20ul CD45-per CP、20ul CD54-PE,C管加入20ul CD45-per CP、20ul同型对照Ig G抗体,室温避光孵育40min;3支管分别加入1毫升溶血素,混匀放置10分钟,避光常温,离心5分钟800r/min;为清除未结合的抗体,去上清液再PBS洗两次,再离心5分钟800r/min两次,加入多聚甲醛1g/L固定后上机检测;流式细胞仪荧光检测变异系数首先调整,一般稳定在2%左右,再调整光电倍增管电压、灵敏度、阈值及颜色补偿,此时流式细胞仪处于最佳工作状态,488纳米氩离子激光为光源,FITC受激发后出现绿色的荧光;启动Elite分析软件,分别测定中性粒细胞前向散射光及侧向散射光,并测定其MFI。9统计方法:统计采用SAS8.0软件包:大鼠血清AMY/LIP、炎症介质TNF-a/IL-1β、内毒素及胰腺微循环血流、胰腺微血管通透性、血液流变学、白细胞-血管内皮细胞粘附因子CD18、CD54表达结果以“x±s”表示,组间显著性差异比较采用方差分析,P0.05为有统计学差异;病理评分为等级资料,组间显著性差异比较采用Chi square test,P0.05为有统计学差异。结果:1 PK对SAP合并IRI大鼠病情指标影响的检测结果1.1 PK对SAP并IRI大鼠血清AMY/LIP影响的检测结果:1.1.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12h,大鼠血清AMY/LIP出现明显升高,AMY由123.38±30.25 u/L迅速上升至2536.47±269.43 u/L,LIP由81.47±12.25u/L迅速上升至746.36±85.32u/L,二者升高均具有显著性差异,P0.01。1.1.2与SAP合并IRI模型组比较,SAP合并IRI且PK干预组造模后12小时,大鼠血清AMY/LIP明显降低,AMY由2536.47±269.43 u/L下降至1867.45±139.86 u/L,LIP由746.36±85.32u/L下降至568.27±108.43 u/L,二者降低均具有显著性差异,P0.05。1.2 PK对SAP合并IRI大鼠血清炎症介质TNF-a/IL-1β表达影响的检测结果:1.2.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12h,大鼠血浆TNF-a和IL-1β表达出现明显升高,TNF-a由3.91±0.41 pmol/L迅速上升至18.63±3.52pmol/L,组间差异P0.01;IL-1β由108.32±26.65 pg/ml上升至269.86±45.87 pg/ml,组间差异P0.01,二者升高均有显著性意义。1.2.2与SAP合并IRI组模型组比较,SAP合并IRI且PK干预组造模后12h,大鼠血浆TNF-a和IL-1β表达水平出现一定程度的降低,TNF-a由18.63±3.52pmol/L降至15.67±3.09pmol/L,组间差异P0.05;IL-1β由269.86±45.87 pg/ml降至245.76±35.13 pg/ml,组间差异P0.05,二者降低均无显著性意义。1.3 PK对SAP合并IRI大鼠血清内毒素表达影响的检测结果:1.3.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12h,大鼠血浆内毒素出现明显升高,由23.38±3.25 EU/L迅速上升至146.67±20.43 EU/L,升高有显著性差异,P0.01。1.3.2与SAP合并IRI组模型组比较,SAP合并IRI且PK干预组造模后12h,大鼠血浆内毒素出现明显降低,由146.67±20.43 EU/L降至127.56±22.48 EU/L,降低无显著性差异,P0.05。1.4 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺组织病理改变影响的检测结果:1.4.1大鼠胰腺组织改变肉眼观察:假手术组大鼠胰腺质地良好,无明显水肿,胃肠道扩张不明显,腹腔内无明显腹水。SAP合并IRI组胰腺充血、水肿明显,伴有片状出血、局灶样坏死及皂化斑,并出现血性腹水。SAP合并IRI且PK干预组胰腺组织仍有充血、水肿、片状出血、局灶样坏死,皂化斑,血性腹水等,但均有所缓解,尤其是片状出血,局灶样坏死。1.4.2光学显微镜下大鼠胰腺病理评分:假手术组大鼠胰腺组织水肿,但无明显出血坏死,间质亦无明显炎细胞浸润。SAP合并IRI组则胰腺明显水肿,伴有明显的片状出血、坏死及大量炎细胞浸润。SAP合并IRI且PK干预组大鼠胰腺仍有水肿及片状出血、坏死及炎细胞浸润等表现,但均出现一定程度的改善。2 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微循环影响的检测结果:2.1 PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微血管血流量及血流速度影响的检测结果:2.1.1与空白对照组比较,SAP并IRI组造模后12小时,胰腺微循环血流量由355.72±26.07下降至263.31±20.95,胰腺微循环血流速度由101.91±11.81下降至76.63±14.79,血流量组间差异P0.01,血流速度组间差异P0.05,组间比较有显著性差异。2.1.2与SAP并IRI组比较,PK处理组胰腺微循环血流量由263.31±20.95上升至307.37±30.23,胰腺微循环血流速度由76.63±14.79上升至88.42±13.32,组间差异P0.05。2.2.PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微动脉及微静脉管径影响的检测结果:2.2.1与空白对照组比较,SAP并IRI组造模后12h,胰腺微动脉管径由17.72±4.07 um下降至8.31±3.05 um,组间差异P0.01;胰腺微静脉管径由24.91±3.81um下降至23.63±3.79um,组间差异P0.05。2.2.2与SAP并IRI组比较,PK处理组造模后12h后,胰腺微动脉管径由8.31±3.05um上升至12.46±4.33um,组间差异P0.05;胰腺微静脉管径由23.63±3.79um上升至24.67±4.12um,组间差异P0.05。2.3.PK对SAP合并IRI大鼠胰腺毛细血管管径、密度、灌注影响的检测结果:2.3.1与空白对照组比较,SAP并IRI组造模后12h,胰腺毛细血管管径出现变细,由5.72±1.07 um下降至3.11±1.15um;毛细血管密度降低,由426.91±23.81下降至297.63±14.79;二者比较有显著性差异,P0.01;毛细血管灌注形式由稳定变为间歇不规则。2.3.2与SAP并IRI组比较,PK处理组造模后12h后,胰腺毛细血管管径出现增粗,由3.11±1.15um上升至4.13.±1.21um;毛细血管密度增加,由297.63±14.79上升至355.16±27.65;二者比较有显著性差异,P0.05,;毛细血管灌注形式虽略有好转,仍为间歇不稳定。3.PK对SAP合并IRI大鼠胰腺微血管通透性影响的检测结果:3.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12小时后,胰腺微血管通透性明显增强,由92.47±14.64 ug/g急速上升至986.42±138.72ug/g,组间差异P0.01,有显著性意义。3.2与SAP合并IRI模型组比较,PK处理组胰腺微血管通透性明显降低,由986.42±138.72ug/g下降至705.23±96.63ug/g,组间差异P0.05,有显著性意义。4 PK对SAP合并IRI大鼠血液流变学影响的检测结果4.1 PK对SAP合并IRI大鼠血液粘度影响的检测结果:4.1.1与假手术组比较,SAP合并IRI组大鼠造模12小时血液低、中、高切边率下全血粘度,血浆粘度,低、高切边率下全血还原粘度均明显上升,分别由6.45±0.47上升至9.67±0.38,3.64±0.34上升至4.75±0.48,3.17±0.31上升至4.29±0.38,1.06±0.08上升至1.65±0.13,5.47±0.42上升至8.79±0.61,3.17±0.31上升至4.29±0.38,组间比较有显著性差异,P0.05。4.1.2与SAP合并IRI组比较,PK处理组造模12小时血液低、中、高切边率下全血粘度,血浆粘度,低、高切边率下全血还原粘度全面下降,分别由9.67±0.38下降至7.75±0.51,由4.75±0.48下降至4.12±0.41,由4.29±0.38下降至3.68±0.29,由1.65±0.13下降至1.32±0.10,由8.79±0.61下降至7.25±0.51,由4.29±0.38下降至3.68±0.29,组间差异均P0.05,组间差异有显著性意义。4.2 PK对SAP合并IRI大鼠红细胞聚集性影响的检测结果:4.2.1与假手术组比较,SAP合并IRI组大鼠造模12小时红细胞聚集指数、血沉、血沉方程K值上升,分别由2.13±0.15上升至2.41±0.11,3.98±1.15上升至6.21±1.94,9.42±1.44上升至16.48±3.38,组间差异均P0.05,组间差异有显著性意义。4.2.2与SAP合并IRI组比较,PK处理组造模12小时红细胞聚集指数、血沉、血沉方程K值下降,分别由2.41±0.11下降至2.23±0.14,由6.21±1.94下降至4.82±1.36,由16.48±3.38下降至12.23±2.63,组间差异均P0.05,组间差异有显著性意义。4.3 PK对SAP合并IRI大鼠红细胞变形性影响的检测结果:4.3.1与假手术组比较,SAP合并IRI组大鼠造模12小时红细胞变形指数、红细胞刚性指数上升,分别由0.78±0.15上升至1.98±0.34,2.21±0.15上升至4.78±0.24,组间比较有显著性差异,P0.05。4.3.2与SAP合并IRI组比较,PK处理组造模12小时,红细胞变形指数、红细胞刚性指数下降,分别由1.98±0.34下降至1.28±0.22,由4.78±0.24下降至4.02±0.16,组间比较有显著性差异,P0.05。4.4 PK对SAP合并IRI大鼠红细胞压积及纤维蛋白原影响的检测结果:4.4.1与假手术组比较,SAP并IRI组大鼠造模12小时红细胞压积及纤维蛋白原上升,分别由38.13±4.15上升至52.45±3.23,3.16±0.25上升至6.46±1.34,组间比较有显著性差异,P0.05。4.4.2与SAP并IRI组比较,PK处理组造模12小时,红细胞压积及纤维蛋白原下降,分别由52.45±3.23下降至42.27±3.54,由6.46±1.34下降至4.82±1.08,组间比较有显著性差异,P0.05。5、PK对SAP合并IRI大鼠血清CD18、CD54影响的检测结果5.1与假手术组比较,SAP合并IRI模型组造模后12小时后,大鼠血清CD18、CD54分别由7.67±1.23上升至29.67±5.23,9.35±2.47上升至31.15±9.36,组间差异P0.01,有显著性意义。5.2与SAP合并IRI模型组比较,PK处理组血清CD18、CD54分别由29.67±5.23下降至20.67±4.29,31.15±9.36下降至24.19±6.26,组间差异P0.05,有显著性意义。结论:1逆行经胰胆管泵入5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠动物模型,方法稳定可靠,可操作性强,胰腺病理变化典型。2在SAP大鼠模型建立基础之上,阻断脾动脉30 min再开放的方法制备IRI大鼠模型,稳定性高,全身情况影响小,血清酶学改变及胰腺病理改变符合实验要求。3 SAP合并IRI大鼠血清AMY/LIP明显升高,使用PK干预后血清AMY/LIP明显降低,表明PK可以降低SAP合并IRI大鼠血清酶学水平。4 SAP合并IRI大鼠血清TNF-a及IL-lβ的水平明显升高,使用PK干预后血清TNF-a及IL-lβ的水平有所降低,但降低水平无统计学意义,表明PK不能减轻SAP合并IRI大鼠血浆炎症介质水平。5 SAP合并IRI大鼠血清内毒素水平明显升高,PK干预后血清内毒素水平虽然略有降低,但降低无统计学差异,说明PK不能减轻SAP合并IRI大鼠血浆内毒素水平。6 SAP合并IRI大鼠胰腺组织水肿、出血、坏死、炎细胞浸润均较重,使用PK干预后,大鼠肉眼及显微镜下胰腺组织病理均得到改善,表明PK是缓解SAP合并IRI大鼠胰腺炎症的有效手段。7 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠胰腺微循环血流量及血流速度;扩张微动脉;扩张胰腺毛细血管管径,升高其分布密度,使其灌注状态趋于稳定,起到改善胰腺微循环的作用。8 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠胰腺微血管通透性,从而起到减少胰腺间质及周围组织的渗出的作用。9 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠全血高、中、低切边率下、血浆粘度、全血还原粘度;红细胞聚集指数、血沉及血沉方程K值;红细胞变形指数及刚性指数;红细胞压积,纤维蛋白原,从而起到减少改善胰腺微循环血流,预防胰腺微循环血栓的作用。10 PK可以明显改善SAP合并IRI大鼠白细胞粘附因子CD18、血管内皮细胞粘附因子CD54表达水平,从而起到减少白细胞与血管内皮细胞粘附的作用,进而减轻了SAP大鼠胰腺组织坏死,对缓解局部及全身炎症反应综合征都有裨益。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576

【参考文献】