子宫内膜再生细胞调控B淋巴细胞治疗小鼠溃疡性结肠炎的作用机理研究

发布时间：2018-03-09 08:50

  本文选题：子宫内膜再生细胞　切入点：B淋巴细胞　出处：《天津医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景溃疡性结肠炎为发生于肠道的慢性非特异性炎症,病程迁延不愈,发病机制复杂,B细胞功能的失衡被认为在溃疡性结肠炎的发病中具有重要作用。目前溃疡性结肠炎仍缺乏有效治疗手段,近年来干细胞治疗在溃疡性结肠炎中得到应用。取自月经血的子宫内膜再生细胞(Endometrial Regenerative Cells,ERC)作为干细胞新来源,不但具有自我更新潜能、间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)样表型特征、免疫调节作用,还具有取材无创、来源相对无限、增殖能力强、避免伦理问题的独特优势。ERC是否可以影响B细胞功能,并通过诱导调节性B细胞(Regulatory B cells,Breg)在结肠炎中发挥保护作用仍有待阐明。目的1.从育龄志愿者妇女月经血中获取ERC,建立从分离、培养、传代、冻存和复苏的方法体系;2.体外明确ERC对B细胞的作用;3.利用葡聚糖硫酸钠建立小鼠结肠炎模型,探讨ERC对结肠炎小鼠体内B细胞的免疫调节作用;4.探究输注的ERC在体内的分布,明确其如何发挥对B细胞的免疫调节作用;5.通过过继治疗的方法探讨ERC是否通过Breg发挥保护作用。方法第一部分:从健康育龄志愿者妇女月经血中分离ERC在健康育龄妇女月经期第2-3日,通过月事杯采集月经血。以密度梯度离心法分离单个核细胞层,并进行体外培养传代扩增。应用流式细胞术,对ERC的免疫表型进行鉴定。第二部分:ERC体外调节B细胞功能磁珠分选小鼠脾脏CD19+B淋巴细胞,在ERC存在或缺失的条件下,以LPS作为刺激剂构建培养体系。通过3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入法检测B细胞的增殖。通过台盼蓝拒染法检测B细胞活性,并经Annexin V、7-AAD染色后通过流式检测B细胞凋亡。流式检测B细胞表面与其活化相关的分子表达。收集培养体系上清液,ELISA法检测上清液中IgM和IgG的含量。收集悬浮的B细胞并经固定破膜,流式检测IL-10+的调节性B细胞比例,ELISA法检测上清液中IL-10的含量。第三部分:ERC调节B细胞功能在结肠炎中的治疗作用造模方法:3%葡聚糖硫酸钠自由饮用的方法诱导Balb/c小鼠结肠炎模型。实验分组:将6-8周龄,体重18-22g的雄性Balb/c小鼠随机分为3组,每组6-8只:(1)正常对照组:小鼠自由饮用蒸馏水;(2)DSS模型未治疗组:自由饮用含3%DSS的蒸馏水7天,随后更换蒸馏水,造模第2、5、8日经尾静脉输注200μl PBS;(3)ERC治疗组:自由饮用含3%DSS的蒸馏水7天,随后更换蒸馏水,造模第2、5、8日经尾静脉输注200μl含有1×106 ERCs的PBS。每日记录小鼠生存情况,测量体重,并观察其一般情况、大便性状与便血情况,计算DAI评分,以评估疾病活动性。造模第10日取材,测量结肠长度,HE染色观察结肠病理损伤。ELISA法检测结肠匀浆液中炎性因子水平。Western blot法和PCR法检测脾脏IL-10的蛋白水平及mRNA转录水平。流式细胞术分析脾脏、肠系膜淋巴结、腹腔灌洗液中免疫细胞比例。PKH26荧光标记ERCs,活体成像检测输入体内后的分布情况。分离具有免疫抑制功能的Breg,通过过继治疗探究ERC是否通过该种细胞发挥保护作用。结果第一部分:从健康育龄妇女月经血中分离ERC通过密度梯度离心法成功从健康育龄妇女月经血中获取ERC。3天后初次换液可见贴壁的原代细胞。随生长逐渐拉伸具有梭形外观,汇合后呈编织状或漩涡状结构。传代后细胞生长增殖速度加快,倍增时间约为24小时。约3代后,其生物学特性及形态学特征趋于一致。流式检测表明ERC具有类似于MSC的分子表型,表达CD90和CD105,而不表达造血干细胞特异性抗原CD34和CD45。且经传代、冻存及复苏之后仍稳定具备此表型。第二部分:ERC体外调节B细胞功能ERC可在不影响B细胞活性的情况下,体外抑制LPS诱导的B淋巴细胞多克隆增殖,且不增加B细胞凋亡。同时ERC可抑制B细胞活化及分泌抗体,并具有剂量依赖的特点。随ERC与B细胞数量比增加,其抑制效应也进一步增强。另一方面,ERC可诱导具有免疫抑制功能的Breg产生及IL-10的分泌。第三部分:ERC通过调节B细胞的功能在结肠炎中发挥治疗作用ERC可提高结肠炎小鼠生存率,降低体重下降幅度,一般状况恶化及大便性状改变或发生便血的时间晚于DSS模型组,且程度较轻,更换饮用水后迅速恢复。大体标本显示,ERC治疗组小鼠结肠长度缩短较少,且大体病理改变(包括肠管僵直、肠壁充血、近端结肠扩张及远端结肠狭窄情况)较轻。HE染色表明,ERC可减轻DSS造成的小鼠结肠炎症病理改变。黏膜结构较完整,黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润情况显著低于DSS模型组,充血及水肿情况明显减轻。同时ERC可显著降低结肠炎小鼠炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平,提高具有抗炎作用的IL-10水平。ERC限制结肠炎小鼠脾脏T淋巴细胞过度增殖,降低CD3+T淋巴细胞的比例,以减少CD4+T淋巴细胞比例更为显著,并提高调节性T细胞比例。同时,ERC抑制脾脏B淋巴细胞分化为浆细胞,减轻结肠炎小鼠肠道组织中IgG抗体的沉积,降低肠道匀浆上清液中IgG的含量。ERC可提高结肠炎小鼠脾脏中IL-10+CD19+Breg比例,提高CD1dhiB细胞在脾脏、腹腔以及肠系膜淋巴结中的比例。同时ERC治疗后小鼠脾脏CD1dhiCD5+B淋巴细胞显著增多,且为IL-10的重要来源。从ERC治疗后的结肠炎小鼠脾脏中分离获得CD1dhiCD5+B淋巴细胞,经过继治疗后,可有效缓解结肠炎症状,促进肠道恢复。ERC在小鼠结肠、肠系膜淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏及肺脏均有所富集。其中远端结肠和肠系膜淋巴结富集最为显著。说明ERC注射入体后,主要分布在炎症反应部位以及炎症引流的淋巴组织。结论1.建立ERC分离培养体系,ERC具有梭形形态及MSC样表型特征,可在体外大量扩增。2.ERC可体外抑制B细胞的增殖、活化、抗体分泌,诱导Breg产生。3.成功利用DSS所诱导的结肠炎模型,阐明ERC可减轻结肠炎症状、促进恢复,并减轻肠道病理损伤和炎症反应。4.输入体内的ERC可募集于炎症损伤部位及炎症引流的淋巴组织。5.ERC可调控免疫细胞平衡,抑制DSS结肠炎模型中B细胞分化为浆细胞及抗体的沉积,另一方面诱导具有免疫调节作用的Breg产生。6.过继治疗结果表明,ERC可能通过诱导Breg发挥其在结肠炎中的治疗作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574.62

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 朱峰,钱家鸣,孙钢,潘国宗;抗中性粒细胞胞浆抗体与溃疡性结肠炎活动性的关系[J];临床内科杂志;2000年01期

2 胡发明;尼古丁治疗溃疡性结肠炎[J];国外医药(合成药 生化药 制剂分册);2000年05期

3 王传文;溃疡性结肠炎与血清抗中性粒细胞浆抗体检测的临床价值[J];河北医药;2000年06期

4 陈现彬,梁玉玲,马伟,王传文;抗中性粒细胞浆抗体在溃疡性结肠炎中的应用[J];济宁医学院学报;2000年04期

5 沈旭东,凌贞,马爱英;吸烟与溃疡性结肠炎[J];人民军医;2000年02期

6 魏玮;42例溃疡性结肠炎患者的诊治体会[J];山西职工医学院学报;2000年01期

7 陆晓清;中药保留灌肠治疗溃疡性结肠炎疗效观察及护理40例[J];时珍国医国药;2000年12期

8 闫伯君;中西医结合治疗溃疡性结肠炎疗效观察[J];天津中医学院学报;2000年04期

9 张名甫,王锐;溃疡性结肠炎的中西医治疗优化选择[J];中国乡村医生;2000年04期

10 侯秀欣;中药保留灌肠治疗溃疡性结肠炎的效果比较[J];现代康复;2000年06期

相关会议论文 前10条

1 杨燕明;柯晓;;溃疡性结肠炎的中西医结合治疗研究进展[A];中华中医药学会脾胃病分会第二十次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2008年

2 何伟;;中西医结合治疗溃疡性结肠炎疗效观察[A];全国中医外治发展论坛暨全国第六次中医外治学术年会与技术展示论文集[C];2009年

3 于成功;许洁茹;;中药溃克灵治疗溃疡性结肠炎的随机对照临床研究[A];第二十二届全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨消化疾病诊治进展学习班论文汇编[C];2010年

4 吴林峰;蔡建庭;;溃疡性结肠炎129例临床分析[A];2005年浙江省消化系疾病学术会议论文汇编[C];2005年

5 许建明;韩玮;;安徽地区溃疡性结肠炎住院病人的多中心临床分析[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（下册）[C];2007年

6 杨大平;杨敏;;溃疡性结肠炎的肛门直肠动力检测及评价[A];2007年贵州省消化内镜诊疗及消化系疾病学术年会资料汇编[C];2007年

7 沈洪;;溃疡性结肠炎中医干预方案及疗效评价研究课题汇报[A];中华中医药学会脾胃病分会第二十三次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2011年

8 崔俊燕;;中药保留灌肠治疗溃疡性结肠炎的护理体会[A];2011年甘肃省中医药学会学术年会论文集[C];2011年

9 窦丹波;黄艳芳;李刚;张正利;岑戎;;溃结通治疗轻中度溃疡性结肠炎随机对照临床研究[A];第二十一届全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨国家级中西医结合消化系统疾病新进展学习班论文汇编[C];2009年

10 聂富平;;张东岳教授论溃疡性结肠炎的预防与治疗[A];中华中医药学会第十二次大肠肛门病学术会议论文汇编[C];2006年

相关重要报纸文章 前10条

1 本报记者 魏鑫;溃疡性结肠炎难预防[N];保健时报;2004年

2 记者 胡蔓、通讯员 高翔;溃疡性结肠炎的病因初步查明[N];湖北日报;2004年

3 高翔 黎昌政;溃疡性结肠炎与基因有关[N];经济参考报;2004年

4 程越明（上海市中医医院副主任医师）;秋季要注意溃疡性结肠炎的复发[N];上海中医药报;2005年

5 窦青;经常腹泻 当心溃疡性结肠炎[N];农村医药报（汉）;2007年

6 江春;甲硝唑可治溃疡性结肠炎[N];医药经济报;2006年

7 吕国梁;中药治溃疡性结肠炎经验[N];医药养生保健报;2007年

8 柑露;怎样应对溃疡性结肠炎[N];大众卫生报;2008年

9 同济医院 姜元喜 许树长 副主任医师;溃疡性结肠炎饮食预防是关键[N];上海中医药报;2008年

10 袁虎;患溃疡性结肠炎要重调养[N];医药养生保健报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 许晓希;子宫内膜再生细胞调控B淋巴细胞治疗小鼠溃疡性结肠炎的作用机理研究[D];天津医科大学;2017年

2 高原;牛兴东学术思想与经验总结及健脾理肠汤加灌肠治疗溃疡性结肠炎临床研究[D];北京中医药大学;2016年

3 申凤鸽;食醋对小鼠溃疡性结肠炎的预防作用及机制研究[D];吉林大学;2016年

4 黄鹤;甘爱萍教授脾胃病学术思想及辨治溃疡性结肠炎临床经验研究[D];湖北中医药大学;2015年

5 郝筱倩;溃疡性结肠炎发病特征及肠黏膜和血清中Beclin1蛋白的表达及其意义[D];青岛大学;2016年

6 杨刚;热休克转录因子2调控自噬在溃疡性结肠炎中作用的研究[D];昆明医科大学;2016年

7 水楠楠;健脾清肠法治疗溃疡性结肠炎理论与实验研究[D];浙江中医药大学;2017年

8 朱旭;TAT-N15在溃疡性结肠炎及炎症相关性结直肠肿瘤中的治疗作用及机制研究[D];华中科技大学;2016年

9 余利华;中药方序贯治疗溃疡性结肠炎的疗效评价及D-柠檬烯作用机制研究[D];南京中医药大学;2017年

10 贾志新;冯五金教授学术思想与临床经验总结及治疗溃疡性结肠炎用药特点研究[D];北京中医药大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 郑容容;血小板计数评价溃疡性结肠炎活动度及严重度的Meta分析[D];福建医科大学;2015年

2 张蕊;溃疡性结肠炎患者结肠黏膜ARE结合活性与HO-1表达的变化[D];河北医科大学;2015年

3 刘国庆;苹果多酚50%乙醇提取物对抗溃疡性结肠炎的作用及其机制研究[D];河北医科大学;2015年

4 赵志敏;化浊解毒愈疡汤对溃疡性结肠炎大鼠TNF-α、SOD的影响[D];河北医科大学;2015年

5 王亮;硫氧还蛋白及超氧化物歧化酶在溃疡性结肠炎中的表达及作用[D];河北医科大学;2015年

6 雷蕾;重度溃疡性结肠炎患者巨细胞病毒感染情况及抗病毒治疗对其影响的Meta分析[D];河北医科大学;2015年

7 滕天立;宧莶草提取物对大鼠溃疡性结肠炎的作用及机制研究[D];浙江省医学科学院;2015年

8 俞敬;滤泡辅助性T细胞和白细胞介素-21对小鼠溃疡性结肠炎的影响研究[D];苏州大学;2015年

9 张艳丽;阿托伐他汀对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子和血管内皮的影响[D];山西医科大学;2015年

10 刘帅;阿托伐他汀溃疡性结肠炎小鼠氧化应激及血管内皮功能的影响[D];山西医科大学;2015年

，

本文编号：1587831