hESCs来源的肝系细胞构建HCV易感的细胞模型和人源化小鼠模型研究

发布时间：2018-03-10 15:21

本文选题：丙型肝炎病毒　切入点：人胚胎干细胞　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）所致的急、慢性感染，并逐渐发展为肝硬化、肝纤维化，甚至肝细胞肝癌，是目前公认的危害全球人类健康的重大传染性疾病。从1989年HCV首次发现和鉴定以来，HCV的发病机制、生命周期、抗病毒药物以及疫苗研究方面进展非常缓慢，这是因为HCV感染具有严格的种属特异性，其自然感染宿主仅限于人和黑猩猩。缺乏HCV自然感染的体外细胞模型以及体内动物模型成为制约HCV研究领域发展的重要原因。人的肝细胞是HCV感染的宿主细胞，但人肝细胞来源有限，且为终末分化细胞；而目前大部分HCV体外研究的细胞模型均为肝肿瘤细胞系细胞，无法模拟正常人肝细胞的感染及深入进行HCV感染机制的研究。将人肝细胞植入小鼠体内构建人源化肝脏嵌合鼠是HCV研究的理想动物模型。感染性HCV和肝损伤免疫缺陷小鼠是构建该疾病模型的前提条件，而选择对HCV易感的、具有高度增殖、分化和植入能力的靶细胞则是关键。常见用于构建人源化肝脏模型的小鼠包括：NOD/SCID鼠、uPA-SCID鼠、ALB-uPA-SCID鼠、FRG小鼠和AFC8-hu HSC/Hep小鼠等。用于移植的细胞多数为尸体肝脏分离获得的原代肝细胞，来源非常有限，体外无法长期培养，且原代肝细胞是终末分化细胞，移植回小鼠肝内后，整合及再生的能力有限，因此原代肝细胞不是构建人源化肝脏小鼠的理想种子细胞来源。人的胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）由于具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，能在体内、外被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，因此成为构建体外HCV感染细胞模型及人源化肝脏嵌合小鼠模型的理想种子细胞。自2001年开始，多个研究团队利用小鼠ESCs、hESCs甚至人的诱导多潜能干细胞（iPSCs），采用不同的诱导分化方案，将其诱导分化成肝细胞样细胞。这些诱导分化来的细胞具有肝细胞相似的形态及肝细胞的功能，但功能仍不完善。随着HCV JFH-1病毒株的分离及其体外Huh7细胞培养模型的建立，对HCV生命周期的研究逐渐深入，人们发现，宿主细胞表面的特异性受体及某些蛋白分子决定了宿主细胞对HCV的易感性。与HCV入侵密切相关的受体及蛋白分子包括低密度脂蛋白受体（LDLR）、CD81、清道夫受体BI（SR-BI）、claudin-1（CLDN-1）及occludin（OCLN）等，其中细胞间紧密连接（tight-junction，TJ）中的OCLN不仅是HCV入侵的必要条件，而且通过介导细胞-细胞间的相互作用决定了细胞的分化命运。因此，我们期望以人胚胎干细胞为种子细胞，通过小分子、细胞因子及细胞外基质（ECM）组合在体外建立并优化分步诱导方案，以提高干细胞的增殖分化效率，获得功能完善的肝细胞样细胞；在此基础上，应用高感染性的HCVcc对诱导分化不同阶段的细胞进行感染展开HCV体外感染规律的研究，寻找具有较高HCV易感性的肝系细胞分化阶段；应用小分子或细胞因子组合，提高肝系细胞对HCV的易感性；将具有高易感性的肝系细胞感染后，再移植回FR小鼠体内，构建HCV易感的人源化肝脏小鼠，获得能够模拟人体自然感染过程的体外HCV感染细胞模型及整合效率更高、HCV易感的人源化肝脏嵌合鼠模型，为研究HCV发病机制、生命周期及抗病毒药物靶点筛选奠定基础和提供技术平台，也为突破疾病动物模型建立的传统模式探索新思路。具体研究内容及结果如下：一、hESCs肝向诱导分化体系建立及HCV感染规律研究根据体内肝脏发育分化的谱系特点，应用stepwise策略，分别在诱导分化的不同阶段加入不同的细胞因子和小分子化合物组合，筛选和建立了将hESCs向成熟、有功能的肝细胞诱导分化的方案；经过上述优化的stepwise诱导分化体系的作用，获得的肝细胞样细胞能够分泌白蛋白、尿素；PAS染色呈阳性；具有ICG的吸收和排泌功能；细胞的同质性较好（细胞中人ALB的表达量可达91.4%）。stepwise诱导分化策略的建立及功能性肝细胞的获得为后续体外HCV易感性研究奠定了基础。通过分步诱导策略，使细胞处于发育分化的特定阶段，再以HCVcc感染不同阶段的细胞，探索HCV体外感染规律的变化。结果显示，诱导分化早期的细胞（ES、DE）不能被HCVcc感染，当诱导分化进入HS阶段可被HCVcc感染，HB阶段的细胞具有较高的HCV RNA拷贝数，成熟肝细胞样细胞对HCV的易感性下降；尽管与HCV入侵相关的OCLN蛋白，在ES向肝细胞分化过程中表达量没有显著改变，但分布位置发生了改变，细胞极性是影响HCV入侵以及影响宿主细胞对HCV易感性的主要原因。二、VEGF调节分化细胞极性从而改变其对HCV易感性的研究本研究将外源性VEGF引入诱导分化体系中，一方面观察其对诱导分化细胞向肝系细胞分化的影响，另一方面验证其对细胞极性形成的影响，进而观察VEGF能否促进诱导分化细胞对HCV的易感性。qRT-PCR和细胞免疫荧光染色结果显示，加入VEGF后，，有助于维持诱导分化细胞的干性，也有助于提高HCV的易感性。VEGF是通过降低OCLN的磷酸化水平，进而促使OCLN由膜顶面向基底膜转移，使细胞处于去极化状态，最终影响细胞对HCV的易感性。三、基于hESCs的人源化肝脏小鼠模型构建及其HCV易感性研究为获得HCV易感的人源化肝脏小鼠模型，本研究采取了新的构建策略：首先选取体外具有较高HCV易感性的HB阶段细胞，将其在体外先进行感染；然后再将感染的细胞肝内原位注射移植回小鼠体内，通过规律性撤除NTBC使小鼠肝细胞发生不可逆的损伤，从而使移植回的人肝祖细胞能够有效整合到Fah/Rag2/小鼠肝内。实验结果证实，经过这种策略构建的人源化肝脏小鼠，能够成功挽救NTBC撤药小鼠的生命，生存率可达75%；肝组织免疫组织化学染色证明，植入的细胞是人源的细胞（FAH、抗人肝细胞抗体、ALB等均为阳性），同时这些细胞也表达HCV的非结构蛋白NS5A和核心蛋白Core；但在构建的人源化肝脏小鼠模型中未检测到病毒血症的发生。四、IFN-β-siRNA干扰提高HCV感染性的体内/外研究 HCV感染肝细胞后，主要引起肝细胞自身免疫反应，通过产生I型干扰素（IFN-α/β）达到清除病毒的目的。因此，我们利用IFN-β的siRNA，探索体内、外干扰IFN-β后，是否可减少肝细胞对HCV的清除，从而使携带病毒的肝细胞整合入FR小鼠肝脏后产生病毒血症。研究表明，经过siRNA干扰作用，持续感染的细胞中HCV RNA拷贝数能够维持在105数量级长达8天，说明针对IFN-β的siRNA干扰，具有减少自身免疫对HCV清除的作用；在体内干扰实验中，我们仍然未观察到病毒血症的发生，但针对IFN-β的siRNA作用可减少肝细胞对病毒的清除。综上，本研究建立了高效的诱导人胚胎干细胞向肝细胞分化成熟的培养体系，诱导分化细胞能够功能性整合入FR小鼠肝内，成功构建了人源化肝脏小鼠模型；揭示了HCV感染肝系细胞的谱系特异性规律，即发育分化早期的肝干细胞就对HCV易感，而在肝系细胞中，肝祖细胞具有更高的HCV易感性；初步阐明细胞间紧密连接及细胞极性影响HCV易感性的机制；提出新的构建HCV易感的人源化肝脏小鼠模型新策略，基于此策略构建的HCV感染的人源化肝脏小鼠模型，为开展HCV生命周期研究、致病机理研究及抗HCV复制药物筛选和评价提供了新的技术平台。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R512.63

【参考文献】