EF24在重症急性胰腺炎大鼠胰腺损伤中的初步研究

发布时间：2018-03-14 04:13

本文选题：EF24　切入点：重症急性胰腺炎　出处：《河北医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一种突发性致死率较高的炎症性疾病,有发展为持续性多器官功能衰竭和广泛的感染性坏死的趋势。急性胰腺炎的病理过程包括水肿和出血,甚至坏死。急性胰腺炎的发展是一个复杂的过程,涉及到生活方式和环境因素等许多方面,如酗酒、胰管狭窄、高脂血症、感染等,但该病机制目前尚未完全研究清楚。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)对低氧异常敏感,在缺氧条件下HIF-1可表现为与低氧程度依赖性的稳定高表达。HIF-1有广泛的靶基因谱,可调控近百种下游基因的表达,包括与炎症发展、组织修复、细胞分化及凋亡、肿瘤生长及血管舒缩控制等生理病理过程,可使机体产生一系列应激反应。而急性胰腺炎腺泡细胞的凋亡及坏死则由缺氧引起,通过缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)激活并引起一系列的应激反应。水通道蛋白(AQP)是一族广泛存在于哺乳动物的上皮和内皮细胞膜上的小分子蛋白,是水分子跨膜快速转运的通道,在不同的哺乳动物的器官的生理和病理过程中发挥关键作用。AQP1基因敲除或基因缺陷的小鼠受损血管通透性增加,促进炎症细胞泄露。最近的研究表明,在阿尔茨海默病、缺血性脑卒中和蛛网膜下腔出血的实验模型中,姜黄素可限制多种离子通道的转运及限制炎症和神经的损伤,并通过该实验推测,姜黄素可能通过上调AQP1的表达限制了脑水肿的发展,但其相关机制尚未清楚。姜黄素类似物联苯二氟酮(diphenyl difluoroketone,EF24)较姜黄素效果更强,稳定性和溶解性更好。以往对EF24在肿瘤方面的研究较多,但在炎症方面的研究甚少,尤其在重症急性胰腺炎导致的胰腺损伤中的作用,目前尚未见研究。目的:本实验建立重症急性胰腺炎大鼠模型,观察SAP时胰腺组织学方面的变化,及应用EF24后HIF-1α、AQP1蛋白和m RNA在胰腺的表达情况,从分子水平阐明在SAP时EF24对胰腺组织的作用机制,为临床上治疗SAP提供新的思路。方法:1将60只SD大鼠随机分成对照(Con)组、SAP模型(SAP)组和EF24(EF24)组,每组再分为6h、12h 2个亚组,每组各10只。2采用间隔1小时分两次于腹腔内注射20%L-精氨酸(L-Arg)3 g/kg的方法诱发动物模型。SAP组于造模后1h腹腔注射聚乙二醇(聚乙二醇:生理盐水=1:1)100μl;EF24组于造模后1h腹腔注射EF24 0.4 mg/kg(溶于聚乙二醇:生理盐水=1:1的混合物100μl中)。Con组腹腔注射聚乙二醇(聚乙二醇:生理盐水=1:1)100μl。3分别于造模后6h、12h留取血、胰腺组织,从股动脉采血,室温放置1h待自然凝固后,3000 rpm离心10min后,取上清,置于-80℃超低温冰箱保存备用。ELISA检测血清IL-6、TNF-α水平,采用RT-PCR、Western-blot的方法观察比较三组胰腺组织HIF-1α、AQP1(Aquaporin-1)m RNA及蛋白的表达差异。4所有数据采用(x±S)表示,应用SPSS 13.0软件包进行统计学数据处理。设α=0.05,P0.05为差异显著,具有统计学意义。结果:1 HE染色观察,模型组胰腺组织可见结构紊乱,细胞及间质充血水肿明显,腺体细胞出血、坏死,炎性细胞浸润,且病理损伤程度随时间延长进行性加重,胰腺病理采用Schmidt评分,提示L-精氨酸成功诱导重症急性胰腺炎,与SAP组相比,EF24组对应时间点胰腺病变程度有所减轻。2血清IL-6:SAP组(6h 99.9±4.6;12h 131.1±8.9)与Con组(6h38.8±5.4;12h 40.9±7.2)各时间点比较,大鼠血清含量明显升高(P0.01);EF24组(6h 74.6±7.0;12h 79.7±8.3)与Con组相比,血清IL-6含量明显升高(P0.01);EF24组与SAP组相比其含量显著降低(P0.01);各组的两个时间点相比,SAP组的12h组高于6h组(P0.01)。3血清TNF-α:SAP组(6h 106.6±10.0;12h 146.3±8.3)与Con组(6h 31.1±5.5;12h 38.7±4.0)各个时间点比较,大鼠血清TNF-α含量明显升高(P0.01);EF24组(6h 75.1±5.0;12h 83.2±6.8)与Con组相比,大鼠血清TNF-α含量明显升高(P0.01);EF24组与SAP组相比显著降低(P0.01);各组的两个时间点相比,SAP组的12h组高于6h组(P0.01)。4 RT-PCR检测HIF-1αm RNA的表达:SAP组和EF24组HIF-1αm RNA的量较Con组均升高(P0.01);EF24组与SAP组相比各个时间点m RNA的量均降低(P0.01);Con组、EF24组HIF-1αm RNA量6h、12h时间点相比各自无显著差异(P0.05),SAP组6h、12h时间点相比,12h m RNA的量高于6h,且有显著差异(P0.01)。5 RT-PCR检测AQP1 m RNA的表达:SAP组较Con组和EF24组AQP1 m RNA的量均下降(P0.01);EF24组较Con组相比各个时间点m RNA的量均下降(P0.01);Con组、EF24组AQP1 m RNA量6h、12h时间点相比各自无显著差异(P0.05),SAP组6h、12h时间点相比,12h m RNA的量低于6h,且有显著差异(P0.01)。6 Western blot检测HIF-1α蛋白的表达:SAP组与EF24组HIF-1α蛋白量与Con组比较各时间点均显著升高(P0.01);EF24组与SAP组HIF-1α蛋白量相比各时间点均下降(P0.01),差异有统计学意义;Con组、EF24组HIF-1α蛋白量6h、12h时间点相比各自无显著差异(P0.05),SAP组6h、12h时间点相比,12h蛋白的量高于6h,且有显著差异(P0.01)。7 Western blot检测AQP1蛋白的表达:SAP组与EF24组和Con组AQP1蛋白量比较各时间点均显著下降(P0.01);EF24组较Con组AQP1蛋白量相比各时间点均下降(P0.01),差异有统计学意义;Con组、EF24组AQP1蛋白量6h、12h时间点相比各自无显著差异(P0.05),SAP组6h、12h时间点相比,12h蛋白的量低于6h,且有显著差异(P0.01)。结论:1 SAP时胰腺中HIF-1α蛋白及m RNA表达升高,AQP1蛋白及m RNA的表达降低,提示此二者参与了重症急性胰腺炎胰腺组织的损伤。2 EF24可以减少SAP血清IL-6、TNF-α水平,减轻胰腺损伤,提示EF24对重症急性胰腺炎起到保护作用。3 EF24可抑制SAP胰腺组织HIF-1α的表达,上调AQP1的表达,提示EF24与HIF-1α、AQP1存在一定的调节关系,EF24通过抑制HIF-1α和上调AQP1的表达减轻SAP胰腺损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576

【参考文献】