短肠综合征肠道菌群变化特点及其在肠衰竭相关性肝损害发病中的作用研究

发布时间：2018-03-17 20:52

本文选题：短肠综合征　切入点：粪便菌群　出处：《南京大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：短肠综合征(shortbowelsyndrome,SBS)是指由于出生缺陷、手术切除等因素导致肠道有效吸收面积不足,进而引发严重营养不良和水电解质紊乱等的一种临床综合征。依据不同的解剖学类型,SBS可分为空肠造口型(Ⅰ型)、空肠结肠吻合型(Ⅱ型)和空肠回肠吻合型(Ⅲ型)。大多数的SBS患者需要依赖肠外营养(parenteral nutrition,PN)来维持机体的能量和营养需求,但长期的肠外营养可引起肠衰竭相关性肝损害(intestinal failure associated liver disease,IFALD)和导管相关性感染等诸多并发症;此外,小肠大部切除本身也将导致全身各系统出现严重的生理功能紊乱,并促使IFALD的发生。因此,针对SBS的治疗目标主要包括:促进剩余肠道功能的康复与适应,尽早恢复经口进食并摆脱PN,预防和减少IFALD等并发症的发生;目前,SBS的肠康复治疗主要着眼于增强肠道吸收能力、减慢肠道蠕动、减少消化液分泌以及手术延长肠管等方面。但是,我们对小肠大部切除后肠道微生态的变化方向,特别是成人SBS患者肠道菌群的变化特点仍了解甚少。肠道菌群在分解代谢肠内容、调控胆汁酸合成与转运、改善肠道免疫功能以及维持肠黏膜屏障完整等方面意义重大。针对儿童SBS患者的研究表明,肠道菌群的紊乱可以阻碍肠适应的进程,破坏肠道功能的代偿,延长PN使用时间,并最终导致不良的临床预后。这提示,阐明SBS肠道菌群变化特点及其与剩余肠道功能的关系可以为肠康复治疗提供新的微生态靶点。现在认为SBS和PN都是导致IFALD的重要原因,且SBS是IFALD的独立危险因素。大量的研究已经报道了 PN参与IFALD发病的相关机制,但是SBS本身如何导致IFALD的发生仍不是很清楚。动物实验发现,未使用PN的SBS小型猪模型的肠道和门静脉中胆汁酸的组成和含量均发生了显著变化,表现为初级胆汁酸增加而次级胆汁酸减少。研究表明,肠道中的初级胆汁酸可被特定的菌群代谢和转化为次级胆汁酸,并进一步通过活化末端回肠法尼酯X受体(farnesoidXreceptor,FXR)参与对肝脏胆汁酸合成的负反馈调控;因此我们推测,SBS肠道菌群的变化可能通过改变肠道胆汁酸的组成,使得肝脏胆汁酸的合成和代谢发生紊乱,进而导致IFALD的发生。本研究首先将利用16S rRNA基因测序技术分析不同亚型的成人SBS患者粪便菌群的变化特点;然后建立Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠模型,研究小肠切除术后不同时间以及不同肠段的菌群构成差异及其与剩余肠道功能的关系;最后,通过检测肠道中胆汁酸代谢相关细菌的相对丰度和胆汁酸的组成,以及肝脏和末端回肠内参与胆汁酸合成及调控的相关分子的表达水平,深入探究SBS肠道菌群变化参与IFALD发病的机制。本研究将为SBS的肠康复治疗和IFALD的防治提供新的思路。全文共分为三个部分:第一部分成人短肠综合征患者粪便菌群变化特点的临床研究研究目的:比较不同亚型的成人SBS患者粪便菌群的变化特点。研究方法:收集自2015年11月至2016年11月于我院住院治疗的Ⅱ型和Ⅲ型SBS患者和来我院体检的健康志愿者的新鲜粪便及其对应的临床资料;提取粪便基因组DNA,PCR扩增其16SrRNA基因V4-V5区,对扩增产物行高通量测序和生物信息学分析。结果:共纳入符合入组标准的Ⅱ型和Ⅲ型SBS患者各5例,并匹配5例健康志愿者作为对照组。三组研究对象(Ⅱ型SBS组、Ⅲ型SBS组和对照组)的性别、年龄和体质指数等无显著差异;两组SBS患者的一般临床特征也无明显差别。Ⅱ型和Ⅲ型SBS患者的粪便菌群α多样性均显著低于对照组(P0.05);且SBS患者粪便菌群Shannon指数和Simpson指数与其剩余小肠长度成正相关,相关系数r分别为0.733(P0.05)和0.891(P0.01)。Ⅱ型SBS患者粪便中变形菌门及其分类下的肠杆菌科的相对丰度显著高于其余两组(P0.01),而厚壁菌门(P0.05)和拟杆菌门(P0.01)的相对丰度则显著低于对照组;Ⅲ型SBS患者粪便中乳酸杆菌科和普氏菌科的相对丰度显著高于对照组(P0.001)和Ⅱ型SBS患者(P0.01)。来自拟杆菌科、毛螺菌科和瘤胃菌科的有益菌属的含量在两组SBS患者粪便中均显著下降。SBS患者的PN使用时间与其粪便菌群中肠杆菌科含量成正相关(r = 0.701,P0.05),而与乳酸杆菌属含量成负相关(r =-0.659,P0.05)。结论:SBS患者粪便菌群的多样性显著下降,其群落组成也与健康人群差别显著,表现为机会致病菌和杂菌增多,而有益菌减少;其中Ⅱ型SBS患者以变形菌门为优势菌群,而Ⅲ型SBS患者以乳酸杆菌属为优势菌群。SBS患者PN使用时间与其粪便菌群的组成有显著相关性。第二部分短肠综合征大鼠肠道菌群变化特点及其与肠道炎症和肠屏障功能关系的研究研究目的:比较大鼠在小肠大部切除术后不同时间以及不同肠段的肠道菌群变化特点,并探究SBS大鼠肠道菌群紊乱与肠道炎症和肠屏障功能的关系。研究方法:选用200-250g的Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,随机分为3组:Ⅱ型SBS大鼠组、Ⅲ型SBS组和假手术大鼠组。通过切除75%的小肠来建立Ⅱ型(不保留回盲部)和Ⅲ型(保留回盲部)SBS大鼠模型,通过小肠离断吻合建立假手术大鼠模型;术后将各组大鼠再随机分为2个亚组,分别饲养2周或4周。到达各自研究终点后,收集各组大鼠的降结肠和回盲部(Ⅱ型SBS大鼠除外)内容物标本,并对菌群16S rRNA基因V4-V5区进行高通量测序;收集近端结肠标本,检测结肠黏膜炎症因子 IL-8(Interleukin-8)、IL-18(Interleukin-18)和 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)的mRNA表达水平;利用免疫组织化学染色检测结肠和末端回肠(Ⅱ型SBS大鼠除外)上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1(zona occludens protein-1)和Occludin的表达;利用Pearson相关系数检验菌群多样性与结肠黏膜炎症因子和回结肠上皮细胞间紧密连接蛋白表达水平的相关性。结果:(1)接受同种手术方式的大鼠模型在术后2周和4周的肠道菌群变化特点基本一致。Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠的结肠和回盲部菌群的α多样性均显著低于假手术大鼠(P0.05),且各组大鼠间菌群β多样性也具有显著统计学差异(P0.001,结肠菌群;P0.01,回盲部菌群)。1)结肠菌群比较:相较于假手术和Ⅲ型SBS大鼠,Ⅱ型SBS大鼠变形菌门的相对丰度显著升高(P0.01),而拟杆菌门的相对丰度则显著降低(P0.01);术后第4周,Ⅲ型SBS大鼠厚壁菌门的相对丰度显著高于其余两组大鼠(P0.01),而拟杆菌门则显著低于假手术大鼠(p0.01);Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠结肠中具有产生短链脂肪酸能力的菌属的含量显著低于假手术大鼠,而Ⅱ型SBS大鼠结肠中肠杆菌科的菌属含量显著高于其余两组。2)回盲部菌群比较:Ⅲ型SBS大鼠厚壁菌门的相对丰度显著高于假手术大鼠(P0.05),而拟杆菌门的相对丰度显著低于假手术大鼠(P0.05);革兰氏阴性的机会致病菌的含量在Ⅲ型SBS大鼠回盲部内明显增加,而益生菌和胆汁酸代谢相关细菌的含量则显著减少。(2)术后第2周,各组大鼠间结肠粘膜炎症因子和回结肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达无显著差异。术后第4周,Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠结肠黏膜炎症因子IL-8,IL-18和TNF-α的mRNA表达水平均显著高于假手术大鼠,且与结肠菌群Shannon指数成负相关,相关系数r分别为-0.486,-0.438,-0.458(P0.05)。术后第4周,Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠结肠和末端回肠上皮细胞间ZO-1和Occludin蛋白的表达均显著低于假手术大鼠,且分别与结肠或回盲部菌群Shannon指数成正相关,相关系数r分别为0.364和0.554(结肠,P0.05)以及 0.508 和 0.467(末端回肠,P0.05)。结论:SBS大鼠剩余肠管的不同部位均存在菌群紊乱;菌群多样性的下降和群落结构的改变在小肠大部切除术后早期即可出现并持续存在。肠道菌群多样性的下降可以加重结肠炎症,并导致肠屏障功能障碍。第三部分短肠综合征大鼠肠道菌群紊乱参与肠衰竭相关性肝损害发病的机制研究研究一短肠综合征大鼠肠道菌群紊乱与肠衰竭相关性肝损害的关系研究目的:观察SBS大鼠肝功能及肝脏病理变化;探究SBS大鼠肠道菌群紊乱与IFALD发病的关系。研究方法:选取200-250gSD大鼠12只,随机分为2组:Ⅲ型SBS大鼠组和假手术大鼠组。通过切除75%的小肠(保留回盲部)建立Ⅲ型SBS大鼠模型,通过小肠离断吻合建立假手术大鼠模型,所有大鼠术后饲养4周。到达研究终点后,采集大鼠下腔静脉血以检测血清胆红素和转氨酶水平;Masson、油红O和天狼猩红染色观察大鼠肝脏病理改变;收集回盲部内容物,检测初级和次级胆汁酸含量,并对菌群16SrRNA基因V4-V5区行高通量测序;留取末端回肠标本,检测 FXR、SHP(small heterodimer partner)和 FGF15(fibroblast growth factor 15)等胆汁酸合成调控蛋白的表达水平;留取肝脏标本,检测胆汁酸合成酶Cyp7a1(cholesterol 7α-hydroxylase)和 Cyp8b1(sterol 12α-hydroxylase)的 mRNA 和蛋白表达水平。结果:SBS大鼠的血清直接胆红素、总胆红素和谷丙转氨酶水平显著高于假手术大鼠(P0.05);且其肝脏内汇管区纤维化、肝细胞气球样变性以及脂滴沉积的程度也明显重于假手术大鼠。SBS大鼠回盲部内与胆汁酸代谢相关的细菌,包括拟杆菌属(P0.01)、梭菌属(P0.05)和双歧杆菌属(P0.01)的相对丰度显著低于假手术大鼠;并导致其回盲部内容物中胆酸(P0.001)和β鼠胆酸(P0.01)等初级胆汁酸的含量显著上升,而脱氧胆酸(P0.001)、石胆酸(P0.05)和ω鼠胆酸(P0.01)等次级胆汁酸的含量显著下降。SBS大鼠末端回肠内负反馈调控肝脏胆汁酸合成的FXR-FGF15信号通路中FXR(P0.05)、SHP(P0.01)和FGF15(P0.001)等关键蛋白的活化显著减弱;此外,SBS大鼠肝脏内胆汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的mRNA(P0.01)和蛋白(P0.05)的表达水平都显著高于假手术大鼠。结论:SBS大鼠的肝功能和肝脏病理变化表明其出现了明显的IFALD。肠道中胆汁酸代谢相关细菌相对丰度的减少使得SBS大鼠肠道内脱氧胆酸等次级胆汁酸的含量显著下降,进而减弱了末端回肠FXR-FGF15信号通路对肝脏中Cyp7a1等胆汁酸合成酶的负反馈调控,从而导致肝脏胆汁酸过度合成、胆汁淤积和IFALD的发生。研究二短肠综合征大鼠肠道次级胆汁酸含量与肠衰竭相关性肝损害的关系研究目的:进一步研究SBS大鼠肠道内次级胆汁酸含量的变化在IFALD发病中的作用,并验证研究一中的结论。研究方法:选取200-250g SD大鼠18只,切除75%小肠建立Ⅲ型SBS大鼠模型,术后将SBS大鼠随机分为3组,分别为生理盐水组(Saline)、脱氧胆酸组(DCA)和抗生素组(Antibiotic)。术后第23-27天,连续5天,每天分别用生理盐水(0.5mL/d)、脱氧胆酸(100mg/Kg/d)和混合抗生素(氨苄西林100mg/Kg/d、新霉素 100mg/Kg/d、甲硝唑 100mg/Kg/d、链霉素 100mg/Kg/d、万古霉素 50mg/Kg/d)灌胃各组SBS大鼠。术后第28天处死大鼠,收集回盲部内容物,检测DCA含量;留取末端回肠标本,检测FXR、SHP和FGF15等蛋白的表达;留取肝脏标本,油红O染色观察肝细胞内脂滴沉积情况,同时检测胆汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的表达以及肝脏胆汁酸代谢调控蛋白FXR和SHP的表达。结果:DCA组SBS大鼠回盲部内容物中DCA的含量显著高于Saline组(P0.05),并趋向于研究一中假手术大鼠的水平,而Antibiotic组SBS大鼠的DCA含量则显著低于Saline组(P0.05)。相较于Saline组,DCA组SBS大鼠末端回肠的FXR、SHP和FGF15的活化水平显著增强(P0.05),而Antibiotic组SBS大鼠的上述蛋白活化水平则显著减弱(P0.05);与此同时,胆汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的mRNA和蛋白的表达水平在DCA组SBS大鼠肝脏中显著下降(P0.05),而在Antibiotic组SBS大鼠肝脏中显著上升(P0.05)。与Saline组相比,脂滴沉积在DCA组SBS大鼠的肝脏内明显减轻,而在Antibiotic组SBS大鼠的肝脏内显著加重。DCA组SBS大鼠肝脏中FXR的表达水平显著低于其他两组(P0.05),但SHP蛋白的表达在三组SBS大鼠肝脏中无显著差异。结论:SBS大鼠肠道内DCA等次级胆汁酸含量的升高可以增强其末端回肠FXR-FGF15信号通路的活化,并负反馈抑制肝脏Cyp7a1等胆汁酸合成酶的表达,从而缓解IFALD。这进一步证明了 SBS大鼠肠道菌群紊乱是通过减少肠道内次级胆汁酸含量来参与IFALD发病的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574

【参考文献】