周细胞凋亡在肝肺综合征肺微血管扩张中的作用研究

发布时间：2018-03-18 13:23

  本文选题：肝肺综合征　切入点：肺微血管扩张　出处：《第三军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的： 肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)是以肝病或门脉高压为基础形成的一种以肺微血管扩张和低氧血症为主要特征的严重血管并发症。HPS一旦发生，肝病患者的死亡率显著增加。肺微血管扩张是HPS最主要的病理变化。周细胞位于微血管壁外侧，其细胞突触呈放射状，沿着血管长轴方向分布，这些突触与多个内皮细胞表面连接，像“爪子”一样牢固的盘踞在微血管壁上，这些特点使周细胞具有调节微血管管径的结构基础；此外，周细胞还表达丰富的与细胞收缩相关的蛋白和蛋白激酶，这些特性使周细胞具有调节微血管管径的功能基础。近年部分研究发现caspase-3激活是周细胞减少的重要调节信号，而周细胞的减少又与某些病理性血管扩张有关。但是，肺周细胞减少是否与HPS肺微血管扩张相关，尚不清楚。胆总管结扎(common bile ductligation, CBDL)模型是目前国内外公认的HPS实验模型。本研究通过培养肺周细胞，观察CBDL大鼠血清对肺周细胞凋亡和caspase-3表达的影响；观察CBDL大鼠肺细胞凋亡、caspase-3表达情况和周细胞的主要标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、神经元胶质抗原2(neuron-glial antigen2, NG2)、desmin的蛋白水平及其阳性细胞率的变化；抑制caspase-3后检测肺细胞凋亡，α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化，以及肺微血管扩张和血氧交换情况，证明如下假设：CBDL产生的血清因子变化，通过血液循环作用于肺微血管，致caspase-3激活，肺周细胞凋亡，进而引起肺微血管扩张、血氧交换异常和低氧血症，最终揭示肺周细胞凋亡在HPS实验模型肺微血管扩张中的重要作用。 方法： 1CBDL大鼠血清对肺周细胞凋亡的作用研究 1.1肺周细胞的培养和鉴定。 1.2采用CBDL法构建HPS大鼠模型，，收集CBDL1wk血清。 1.3CBDL大鼠血清培养肺周细胞后，分别用TUNEL和western blot检测其凋亡和caspase-3表达情况。 2CBDL大鼠中肺周细胞的变化研究 2.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型。 2.2分别用TUNEL和western blot检测CBDL大鼠肺细胞的凋亡和caspase-3的表达。 2.3分别用western blot和免疫组化法检测CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。 3抑制caspase-3对CBDL大鼠肺周细胞的影响及HPS的作用研究 3.1采用CBDL法构建HPS大鼠模型，手术后第一天起每天给模型大鼠腹腔注射caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK，连续2wk。 3.2用TUNEL法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺细胞的凋亡情况。 3.3分别用western blot和免疫组化法检测抑制caspase-3后CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其阳性细胞率的变化。 3.4分别用血气分析和HE染色法观察抑制caspase-3后CBDL大鼠血氧交换和肺微血管扩张情况。 结果： 1.成功培养出高纯度的肺周细胞：倒置显微镜下见培养的细胞呈梭型或星芒状，单核，偶见双核，核卵圆形，有细胞突起，漩涡或栅栏状生长，无接触性抑制；经α-SMA、desmin和NG2免疫荧光染色测定为阳性，CD31染色为阴性。 2. CBDL大鼠血清促进肺周细胞中TUNEL阳性细胞的增加和caspase-3的表达。 3. CBDL后肺TUNEL阳性细胞和caspase-3表达显著增加然后逐渐降低，其中CBDL1wk时为最高值，α-SMA、desmin、NG2的表达水平及其阳性细胞率显著减少。 4.早期使用caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK显著降低了CBDL大鼠肺TUNEL阳性细胞数量，抑制了α-SMA、desmin、NG2的表达水平及其阳性细胞率的下降，减轻了肺微血管扩张，改善了血氧交换。 结论： 1.成功建立了一套简单有效的肺周细胞培养方法。 2. CBDL引起的血清变化促进了肺周细胞凋亡。 3. Caspase-3激活导致肺周细胞凋亡可能是CBDL大鼠肺α-SMA、desmin和NG2表达水平及其阳性细胞率下降的原因。 4.早期使用caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK可能通过减少CBDL大鼠肺周细胞凋亡，从而抑制肺微血管扩张和HPS形成。早期抑制caspase-3可能成为预防实验性HPS形成的一种有效措施。
[Abstract]:Background and purpose:
Hepatopulmonary syndrome (hepatopulmonary syndrome HPS) is a liver disease or portal hypertension is a basic form to the pulmonary micro vascular complications of.HPS serious vascular dilatation and hypoxemia as the main feature of the event, patients with liver disease mortality increased significantly. The pulmonary microvascular expansion is the main pathological changes of HPS cells in the micro week. The vessel wall outside the cell synapses were radial distribution along the long axis of the vessel, synaptic connections with multiple endothelial cell surface, like "claws" firmly entrenched in the microvascular wall, these features make the cell structure is adjusting the peripheral microvascular diameter; in addition, peripheral cells also express the rich contraction associated protein and protein kinase and cell, these properties make cells has the function of adjusting the microvascular diameter. In recent years, some studies have found that caspase-3 activation is reduced the weight of pericytes To adjust the signal, and reduce the pericytes is related to some pathological vascular dilatation. However, peripheral lung cells decreased whether microvascular expansion associated with lung HPS, is unclear. Common bile duct ligation (common bile, ductligation, CBDL) model is recognized at home and abroad at present HPS model. In this study, through the cultivation of peripheral lung to observe the effect of serum cell CBDL expression in rats of peripheral lung cell apoptosis and caspase-3; observation of lung cell apoptosis in CBDL rats, the expression of Caspase-3 and the main sign of pericytes protein alpha smooth muscle actin (-smoothmuscle alpha actin, alpha -SMA), glial antigen 2 (neuron-glial antigen2, NG2), desmin protein level changes and the rate of positive cells; detection of lung cell apoptosis, inhibition of Caspase-3 alpha -SMA, desmin, NG2 protein level and its change rate of positive cells, and pulmonary capillary dilation and oxygen exchange And prove the following hypothesis: the changes of serum cytokines CBDL, on pulmonary microvascular function through blood circulation, induced caspase-3 activation, peripheral lung cell apoptosis, thereby causing pulmonary capillaries, oxygen exchange abnormalities and hypoxemia, and finally reveals the important role of apoptosis in peripheral pulmonary HPS experimental model of pulmonary microvascular expansion.
Method锛

本文编号：1629758