IL-22对乙醛诱导的HSC-T6s增殖活化的影响及机制探讨
本文选题：白介素-22 切入点：酒精性肝纤维化 出处：《山西医科大学》2017年硕士论文
【摘要】：目的:研究白介素-22(interleukin-22,IL-22)对乙醛诱导的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)增殖活化的影响,并探讨抗氧化轴Nrf2-keap1-ARE在该作用中的地位。方法:(1)HSC-T6s的培养:用含10%体积分数胎牛血清、1%青-链霉素混合液的DMEM高糖培养基培养HSC-T6s,并置于37℃、5%CO2的孵箱中。(2)酒精性肝纤维化体外模型的建立:对数生长期的大鼠HSC-T6s分为空白对照组和乙醛刺激组。空白对照组:常规培养HSC-T6s;乙醛刺激组:在常规培养基中加入不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的乙醛,并于干预后的24h和48h,四甲基偶氮唑蓝法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl)-2,5-di-phenly retrazolium bromid,MTT法)检测各孔570nm处吸光度(Optical Density,OD)值,以此筛选出最佳乙醛干预浓度及时间。(3)IL-22对乙醛诱导的HSC-T6s增殖活化的影响:对数生长期的HSC-T6s分为5组,空白对照组(常规培养48h)、乙醛模型组(常规培养基中加入200μmol/L乙醛作用48h)及低、中、高剂量IL-22干预组(含200μmol/L乙醛的培养基预处理24h后,再分别加用10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml IL-22共培养24h)。MTT法检测HSC-T6s增殖情况,流式细胞术检测HSC-T6s细胞周期分布,western blotting及细胞免疫组化(immunocytochemistry,ICC)检测α-平滑肌抗原(α-Smooth muscle antigen,α-SMA)蛋白的表达。(4)IL-22作用机制的探讨:对数生长期的HSC-T6s如(3)分组,western blotting及ICC法检测核因子相关因子(nuclear factor erythroid-2related factor,Nrf)2蛋白的表达及定位,分光光度法检测培养上清液中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量。采用SPSS17.0软件进行统计学分析,结果以均数±标准差(X±S)表示,P0.05认为差异有统计学意义。多组样本均数的两两比较采用One-way ANOVA分析。结果:(1)HSC-T6s细胞贴壁生长良好,且性能稳定。(2)与空白对照组相比,不同浓度乙醛刺激后HSC-T6s的OD值均升高(P0.05),尤以200μmol/L作用48h最明显,故选作后续造模条件。(3)流式细胞术结果显示乙醛刺激HSC-T6s后G0/G1期细胞比例明显降低,S期比例明显升高,而加用IL-22干预后HSC-T6s则发生G1/S期阻滞,且呈现出剂量依赖性;western blotting和ICC结果显示模型组HSC-T6s内α-SMA表达明显上调(P0.05),而梯度浓度的IL-22则可呈剂量依赖性的抑制α-SMA蛋白表达。(4)western blotting结果显示各组Nrf2总蛋白表达无明显差异;但Nrf2核蛋白在空白对照组表达很少,模型组表达明显增加,梯度浓度IL-22干预后可呈剂量依赖性进一步促进其表达(P0.05)。ICC结果也显示,与空白组相比,模型组Nrf2胞核阳性率增加,加用IL-22干预后,随着IL-22浓度增加,Nrf2胞核阳性率也进一步递增,差异均有统计学意义(P0.05)。分光光度法结果显示,与空白组相比,模型组上清液中MDA及GSH含量均明显升高(P0.05);加用梯度浓度IL-22干预后MDA含量显著下降,而GSH含量进一步明显升高(P0.05),二者均存在剂量依赖性。结论:(1)乙醛诱导HSC-T6s活化增殖,成功构建了酒精性肝纤维化的体外研究模型;(2)IL-22对乙醛诱导的HSC-T6s活化增殖具有显著的抑制作用,该作用至少部分是通过促进HSC-T6s内Nrf2核转位及下游靶基因GSH表达、增强机体抗氧化轴Nrf2-keap1-ARE活性而实现的。
[Abstract]:Objective : To study the effect of interleukin - 22 ( IL - 22 ) on the proliferation and activation of hepatic stellate cells ( HSCs ) induced by acetaldehyde . The expression and localization of 伪 - smooth muscle antigen ( 伪 - SMA ) were detected by flow cytometry . Compared with blank group , the positive rate of MDA and GSH increased significantly in the model group ( P0.05 ) .
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575
【参考文献】
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，本文编号：1673638
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