从肝细胞的成脂性改变探讨非酒精性脂肪性肝病的发病机制

发布时间：2018-03-31 23:30

本文选题：非酒精性脂肪性肝病　切入点：高脂饮食　出处：《华中科技大学》2014年博士论文

【摘要】：目的：建立高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型,并明确其病理生理变化。方法：选取雄性C57BL/6J小鼠60只,随机分为正常饮食组和进食高脂饲料组(42%脂肪供能),每组30只。持续喂养24周,分别于造模12周、16周、20周和24周各组随机抽取5只动物处死。观察体重、肝脏湿重和肝脏组织学的变化。心脏取血检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)和空腹血糖(Glu)的变化。SABC免疫组化技术检测小鼠肝组织中CD68的变化。运用RT-PCR技术检测肝组织中c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)的表达水平。结果：从12周开始,HE染色显示超过70%的高脂饲养小鼠的肝脏发生了脂肪变,到20周所有高脂饮食组小鼠的肝脏均发生了脂肪变,其肝脏脂肪变的程度未随着喂养时间的延长而明显加重。油红O染色显示高脂饮食组小鼠肝细胞内出现大小不等的橘红色脂滴。从12周开始高脂饮食组小鼠体重、肝脏湿重明显高于正常饮食组小鼠(P0.05)。高脂小鼠血清ALT、TG和Glu的水平逐渐升高,并从16周开始与正常饮食小鼠相比有显著差异(P0.05)。而高脂饮食组血清Alb水平逐渐降低。免疫组化染色显示高脂饮食小鼠肝脏组织中CD68的表达较正常饮食组增加。RT-PCR显示在喂养24周后高脂饮食小鼠肝组织中JNKl的表达量是正常饮食组的3-7倍。结论：高脂饮食饲养C57BL/6J小鼠12～24周可成功构建NAFLD模型,该模型的特征为肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变。高脂饮食能激活肝组织JNK1的表达,诱导和加重肝脏的胰岛素抵抗。目的：研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型和患者肝穿标本肝脏中脂肪细胞特异性蛋白的表达变化及意义。方法：对高脂饮食造模的雄性C57BL/6J小鼠及正常饮食的同种小鼠分别在12周、16周、20周和24周运用RT-PCR和Western blot技术检测肝脏组织中脂肪细胞标志物的变化：脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体y (PPARγ)、 CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPa)和脂联素(adiponectin)。Western blot技术检测肝脏组织中上皮细胞的标志蛋白E-Cadherin的表达。对16例肝穿病理诊断脂肪肝患者和10例正常肝组织石蜡包埋标本行切片及SABC免疫组化染色检测PPARy的表达定位,并应用免疫荧光双重染色技术明确脂肪细胞标志物aP2在NAFLD患者肝组织中的表达定位。结果：RT-PCR检测发现,高脂饮食组小鼠在喂养24周过程中肝脏aP2和PPARy的表达较正常饮食组小鼠分别增加了2-3倍和4-9倍,Western blot也显示了其同样的变化。而高脂饮食组小鼠肝脏C/EBPa和adiponectin的mRNA表达较正常饮食组小鼠降低,仅C/EBPa在喂养24周时表达较正常饮食组升高约1.4倍,Western blot检测也显示了高脂饮食组C/EBPa和adiponectin蛋白的表达均较正常饮食组降低。肝脏组织中E-Cadherin蛋白的表达在高脂饮食组随着喂养时间的延长逐渐减低。免疫组化染色发现PPARy在NAFLD患者肝脏中表达增加,并主要表达于细胞核内。组织切片免疫荧光双重染色结果显示NAFLD患者肝脏中有aP2表达,并且aP2与白蛋白的表达位置重叠,均出现在肝细胞胞浆内,而白蛋白的表达明显较对照组降低。结论：在高脂饮食小鼠NAFLD模型和NAFLD患者肝脏中,我们发现肝细胞内可表达部分脂肪细胞特异性蛋白,即发生了成脂性改变,而其自身上皮细胞表型和分泌功能均降低。目的：研究原代分离的脂肪变肝细胞对kupffer细胞系RAW264.7活化的影响。方法：在高脂饮食组和正常饮食组均喂养到20周时,利用胶原酶灌流+低速等密度percoll离心法分离培养小鼠原代肝细胞。油红O染色检测肝细胞的脂肪变情况。免疫荧光染色检测肝细胞内脂肪细胞标志物aP2和上皮细胞标志物E-cadherin的变化。原代分离的肝细胞体外培养24小时后,在transwell小室中与6孔板内的kupffer细胞系共培养。共培养48小时后,ELISA法检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、MCP-1、 IL-6、IL-18的变化。CFSE染色kupffer细胞及流式细胞术检测其增殖情况。Western blot检测kupffer细胞CD68表达的变化。结果：油红O染色可显示高脂饮食组小鼠原代肝细胞内存在大量橘红色脂滴。免疫荧光双重染色可见高脂饮食组小鼠原代肝细胞内脂肪细胞标志物aP2与白蛋白(Alb)共定位,并且其Alb和E-cadherin的表达均较正常饮食组降低。共培养48小时后,脂肪变肝细胞+kupffer细胞组的细胞上清液中炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-18的表达较其他对照组明显升高(P0.05),并且脂肪变肝细胞自身也能分泌炎症因子。流式细胞术检测CFSE染色与脂肪变肝细胞共培养的kupffer细胞出现明显增殖。Western blot检测脂肪变肝细胞+kupffer细胞组共培养的kupffer细胞CD68蛋白的表达量较对照组明显升高(P0.05)。结论：成脂性改变的肝细胞虽然其自身分泌功能和上皮细胞表型被削弱,但是能分泌细胞因子,并能在体外刺激kupffer细胞的活化,促进其增殖,从而共同参与了脂肪性肝炎的发生。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.5

【参考文献】