转染丙型肝炎病毒NS2基因对人肝细胞及环境中巨噬细胞的影响

发布时间：2018-04-04 05:45

  本文选题：HCV　切入点：NS2　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）于1989年被Choo等发现，到目前为止，全球约有1.7亿人感染，占世界人口的2～3%。我国也是丙型肝炎高发区，健康人群中抗HCV阳性率为3.2%。HCV感染的慢性化率较高，由此增加了发展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HepatocellularCarcinoma, HCC）及其他相关致死性肝病的风险。 丙型肝炎病毒(HCV)属黄病毒科，基因组为单股正链RNA，含有一个开放阅读框，编码一个多聚蛋白前体，后者在病毒自身蛋白酶和宿主蛋白酶的作用下被切割为结构蛋白core、E1、E2、p7，和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B一共10种病毒蛋白。作为连接HCV结构蛋白和非结构蛋白关键部分的NS2蛋白一直是研究的热点，其氨基端依赖于宿主信号肽切割，羧基端则由NS2-NS3蛋白酶催化自身切割与NS3分离而释放。释放出的具有功能的NS2蛋白为病毒感染细胞所必需，还可参与调控宿主细胞的增殖和基因表达。Erdtmann等发现NS2与肝脏特异的促凋亡因子CIDE-B(celldeath-inducing DFFA-like effector B)相互作用，抑制CIDE-B诱导的细胞凋亡。NS2还可抑制IFN-β基因启动子的活性，从而阻止宿主体内信号通路发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。本研究应用HCV2a型JFH-1株基因为模板，构建了HCV NS2真核表达质粒pEGFP-C1-NS2，脂质体转染人肝细胞株L02，并获得稳定转染的单克隆株，从对L02增殖水平及所分泌细胞因子的影响角度了解NS2对宿主细胞的作用。 肝脏中存在枯否氏细胞（巨噬细胞）、NK细胞等固有免疫细胞，它们在机体抗病毒感染中发挥着重要的作用，但多个研究表明，HCV在肝脏微环境中可通过自身蛋白干扰免疫细胞的信号转导，从而抑制免疫应答，有利于持续存在于宿主体内。本研究通过应用transwell小室将转染NS2基因的L02细胞与人巨噬细胞共培养，从不同水平检测巨噬细胞变化，旨在研究HCV NS2蛋白、肝细胞、巨噬细胞三者在肝脏微环境中的相互作用，以期为以HCV为基础的肝细胞癌发生机制和HCV免疫逃逸研究提供新的视角。 方法： 1从JFH-1株(HCV2a)全长基因质粒上通过PCR方法扩增HCV NS2基因,连接至pMD18-T载体，测序正确后，经BamHI、HindⅢ双酶切，将其克隆至真核表达质粒pEGFP-C1，构建重组真核表达质粒pEGFP-C1-NS2，经HindⅢ、BamHⅠ双酶切后琼脂糖电泳鉴定并测序。 2分别提取及纯化pEGFP-C1-vector和pEGFP-C1-NS2质粒，脂质体转染肝细胞株L02并G418药物筛选，获得稳定转染重组质粒的单克隆细胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。通过荧光显微镜观察GFP蛋白荧光强度，提取细胞总RNA后PCR检测目的基因GFP-NS2，提取细胞总蛋白行Western blot检测GFP-NS2融合蛋白的表达以鉴定。 3体外培养L02、L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)三种细胞，待对数生长期，消化计数后接种于96孔板（1×104个/孔），分别于培养24h，48h，72h时，每孔加入MTS溶液20μl，37℃培养箱孵育4h，吸取孔内培养液，用酶标仪检测490nm处的吸光度值,MTS法检测不同时间点肝细胞增殖的动态变化。 4体外培养L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三种细胞，待对数生长期，消化计数后接种于6孔板（1×106个/孔），24h后提取细胞总RNA，Real-time PCR检测细胞因子（IL-8、IL-10、TGF-β）mRNA水平变化。 5将L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三种细胞，与巨噬细胞THP1共培养，并设单独培养的巨噬细胞THP1为对照。于共培养6h、10h后，收取巨噬细胞THP1提取总RNA，Real-time PCR检测细胞因子（IL-1β、IL-8、IL-10、TGF-β）mRNA水平变化；于共培养12h、24h后，取巨噬细胞THP1上清，使用CBA Human Inflammatory CytokinesKit检测巨噬细胞THP1分泌的炎性细胞因子的变化；于共培养12h、24h后，收取巨噬细胞THP1提取细胞总蛋白，Western blot检测细胞内转录因子STAT3、磷酸化STAT3的活性。 结果： 1成功构建真核表达质粒pEGFP-C1-NS2，经HindⅢ、BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定有约650bp大小片段存在，测序结果显示与Genbank记载序列一致。 2获得稳定转染重组质粒的单克隆细胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。经PCR检测L02(pEGFP-C1-NS2)组中有目的基因GFP-NS2的表达，Western blot检测结果显示有GFP-NS2融合蛋白的表达。 3L02细胞增殖曲线显示，L02细胞组、L02(pEGFP-C1-vector)细胞组和L02(pEGFP-C1-NS2)细胞组，三组细胞之间增殖水平无差别（P0.05）。 4L02细胞Real-timePCR结果显示：L02(pEGFP-C1-NS2)细胞组抑炎因子IL-10、TGF-βmRNA水平较L02细胞组和L02(pEGFP-C1-vector)细胞组升高（P0.05）;与L02组比较， L02(pEGFP-C1-vector)细胞组和L02(pEGFP-C1-NS2)细胞组促炎因子IL-8mRNA表达水平降低，但转质粒两组间无差异（P0.05）。 5THP1细胞Real-timePCR结果显示，与L02(pEGFP-C1-NS2)共培养6h后THP1细胞中细胞因子IL-1β、IL-8、TGF-β mRNA水平高于其他三个对照组（P0.05）细胞因子IL-10在四组之间无差异（P0.05）；而在共培养10h后，与L02(pEGFP-C1-NS2)共培养的THP1细胞中IL-10mRNA水平高于其他三个对照组，有统计学意义（P0.05）。 6CBA结果显示，，THP1与L02(pEGFP-C1-NS2)共培养12h、24h后其上清中细胞因子IL-6、IL-1β、TNF、IL-10均显著高于其他三个对照组（P0.05）。 7L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三种细胞，与巨噬细胞THP1共培养12h、24h后，提取巨噬细胞THP1蛋白，western blot显示STAT3总量及磷酸化STAT3表达无明显改变。 结论： 1成功构建真核表达质粒pEGFP-C1-NS2，并获得稳定转染重组质粒的单克隆细胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。 2稳定转染HCV NS2的L02细胞抑炎因子IL-10和TGF-βmRNA表达增高。 3与转染HCV NS2基因的L02细胞共培养，可促巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和负调节因子IL-10、TGF-β在mRNA水平或蛋白水平表达增高。
[Abstract]:Objective : Hepatitis C virus ( HCV ) was detected by Choo et al . in 1989 . So far , about 170 million people worldwide have been infected , accounting for 2 - 3 % of the world ' s population . In China , the positive rate of HCV infection is 3.2 % . The chronic rate of HCV infection is high , thereby increasing the risk of developing liver fibrosis , liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma ( HCC ) and other related fatal liver diseases .

Hepatitis C virus ( HCV ) belongs to Flaviviridae , the genome of which is a single strand of positive strand RNA , and contains an open reading frame , which encodes a multimeric precursor which is cleaved into structural protein core , E1 , E2 , p7 , and non - structural protein NS , NS3 , NS4A , NS4B , NS5A and NS5B under the action of virus autoprotease and host protease .

In this study , we use transwell small cell to co - culture L02 cell transfected with NS gene with human macrophage to study the interaction between HCV NS3 protein , liver cell and macrophage in the microenvironment of liver , and to provide a new perspective for the research of HCV - based HCC pathogenesis and HCV immune escape study .

Method :

1 From JFH - 1 ( HCV2a ) full - length gene plasmid , the gene was amplified by PCR and ligated to pMD18 - T vector . After the sequencing was correct , the recombinant eukaryotic expression plasmid was cloned into the eukaryotic expression plasmid , and then the recombinant eukaryotic expression plasmid was constructed by agarose gel electrophoresis and sequencing .

2 . The expression of GFP - 2 fusion protein was determined by Western blot .

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本文编号：1708621