不同基底硬度在调控HepaRG细胞分化为肝细胞样细胞中的作用

发布时间：2018-05-03 09:11

  本文选题：急性肝衰竭 + 生物人工肝　； 参考：《广西医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景及目的:急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是因肝细胞大量坏死至肝功能严重不足而引起的一系列临床症状的综合征,病死率高。肝移植仍是目前治疗急性肝衰竭最主要的手段,然而因供体器官短缺、免疫排斥、费用昂贵等原因,肝移植仍不能被广泛运用到临床上。这使得发展生物人工肝(bioartificial liver,BAL),延长急性肝衰竭患者的生存期,提高他们的生存状态,引起人们高度重视。而如何获取大量可利用肝细胞一直以来被认为是发展生物人工肝的难题。HepaRG细胞是在2002年首次分离出来的肝祖细胞系,HepaRG细胞在二甲基亚砜(DMSO)诱导下可分化为有功能的肝细胞样和胆管细胞样细胞,分化后的细胞适用于BAL、人肝细胞模型、研究病毒性肝炎机制等,但DMSO也会抑制分化后的细胞表达ALB、细胞色素P450、氨的消除、细胞增生等特殊肝功能,这促使我们去寻找更有效的诱导HepaRG细胞分化的方法。而近年来有国外研究发现细胞外基质(extracellular matrix,ECM)可以调控细胞生物学行为比如细胞迁移、增生、分化等。本研究立足以此,通过构建基底弹性梯度ECM系统来诱导HepaRG细胞分化,初步探索基底硬度调控HepaRG细胞快速分化为肝细胞样细胞的可行性,为BAL提供新的肝细胞来源。方法:1、构建4组不同硬度的基底(4s组、8s组、16s组、Glass组)和ALB-GFP荧光报告细胞系系统,HepaRG细胞分别接种于4种基底2上,通过检测细胞ALB表达和运用倒置显微镜观察HepaRG细胞分化前后的形态变化,来鉴定各组HepaRG细胞分化效果;2、阿尔玛蓝(Alamar bule)检测各组细胞增殖情况;3、免疫荧光染色检测各组细胞力学响应转录因子(YAP)的表达,初步探查软的基底诱导HepaRG细胞分化原因。结果:1、ALB-GFP荧光报告细胞系系统及运用Image J软件对ALB表达分析结果显示:在第4h,4s组分别与8s组、16s组、Glass组HepaRG细胞中ALB的表达量比较,差异没有统计学显著性(t=0.791,1.389,2.481,P0.05);在第4d,4组HepaRG细胞中ALB的表达量互相比较,差异有统计学显著性(F=82.60,P0.05),4s组ALB的表达量高于16s组和Glass组,差异均有统计学显著性(t=12.410,12.520,P0.05),4s组与8s组比较,差异没有统计学显著性(t=2.603,P0.05);在第7d,4组HepaRG细胞中ALB的表达量互相比较,差异均有统计学显著性(F=27.02,P0.05),4s组分别和8s组、16s组、Glass组比较,其ALB的表达量较高,差异均有统计学显著性(t=3.266,6.725,8.005,P0.05)。2、倒置显微镜观察结果显示:在诱导分化第0天(4h),HepaRG细胞形态呈现一致的瘦长形细胞,随着培养时间延长,HepaRG细胞从第4天达到汇合后开始出现分化;在第7天,HepaRG细胞基本分化为两种形状不同的细胞,一种呈现肝细胞样颗粒状上皮细胞,有1至2个细胞核,另一种围绕着第一种细胞,呈现扁平状,有清晰的细胞质,肝细胞样细胞约占总细胞数50-55%。3、Alamar bule检测结果显示:在第4d,4s组的细胞总数分别和8s组、16s组、Glass组比较,差异均无统计学显著性(t=1.550,0.518,3.106,P0.05);在第7d,4s组的细胞总数分别和8s组、16s组、Glass组比较,差异仍无统计学显著性(t=0.025,1.408,3.889,P0.05)。4、免疫荧光染色检测YAP结果显示:最软基底上的YAP主要定位在细胞质里,中间硬度基底上的YAP在细胞质和细胞核里都有定位,最硬基底上的YAP主要定位在细胞核里。结论:1、软的基底更有利于肝祖细胞系HepaRG细胞快速向肝细胞样细胞分化。2、软的基底在诱导HepaRG细胞分化时不影响细胞增殖活性,HepaRG细胞有望为生物人工肝提供所需的肝细胞。3.YAP在基底硬度调控hepaRG细胞向肝细胞分化中起到重要作用。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : Acute liver failure ( ALF ) is one of the most important methods for treating acute liver failure . The results showed that there was no statistical significance ( t = 2.603 , P < 0.05 ) . The expression of ALB was significantly higher in the 4 s and 4 s groups ( t = 3.266 , 1.389 , 2.481 , P0.05 ) .

【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.3

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本文编号：1837899