骨髓间充质干细胞来源exosomes对大鼠急性胰腺炎损伤后修复作用的实验研究

发布时间：2016-11-25 10:09

  本文关键词：骨髓间充质干细胞来源exosomes对大鼠急性胰腺炎损伤后修复作用的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

《川北医学院》 2015年

骨髓间充质干细胞来源exosomes对大鼠急性胰腺炎损伤后修复作用的实验研究

徐均  

【摘要】：研究背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种严重威胁人们生命健康的急腹症,病情发展迅速,救治难度大,死亡率极高。目前认为胰酶异常激活、白细胞过度激活以及炎性因子级联反应是致使AP发病及迅速发展的重要因素。尤其在早期白细胞过度激活促使大量促炎因子释放,严重破坏机体促炎与抗炎间的平衡,致使肝、肾、肺以及小肠等全身多器官受到不同程度的损伤,也是其致死的重要原因之一。有研究证实骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)通过强大的抗炎与组织修复作用能够明显改善急性胰腺炎患者的预后,但临床也出现由不良分化所致恶变、心肌钙化、肺纤维化以及由细胞输注导致血管闭塞等并发症。最近,研究发现BMSCs可以释放一类由真核细胞的内吞体产生并被分泌出细胞的膜性囊泡exosomes(即BMSCs-exosomes),能够发挥出与BMSCs移植相似的生物学效应,同时也可以消除BMSCs移植的潜在安全隐患。目前,尚未见报道关于BMSCs-exosomes干预治疗AP的相关研究。因此,本课题拟通过分离提纯与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞来源exosomes,然后通过建立SD大鼠AP模型,初步探讨BMSCs-exosomes对大鼠急性胰腺炎损伤后修复作用及可能的作用机理,为深入研究BMSCs-exosomes替代MSCs临床治疗AP提供一定的理论基础。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞来源exosomes的分离提纯与鉴定目的:通过对大鼠骨髓间充质干细胞提取分离与原代培养,以及分离纯化骨髓间充质干细胞来源exosomes(BMSCs-exosomes),为后续的动物干预实验做准备。方法:分离提取健康成年的雄性SD大鼠股骨髓腔内的骨髓间充质干细胞,体外进行原代培养至第三代,收集细胞培养的上清液,采用Exo Quick-TC exosomes提取试剂盒分离提取培养上清液中骨髓间充质干细胞分泌的exosomes,并通过负染透射电镜进行BMSCs-exosomes鉴定。结果:BMSCs原代细胞经经上诉培养方法,细胞在48小时后逐渐贴壁,8-11d镜下呈梭形或多角形的多样性,约两周覆盖了整个可见的细胞培养瓶壁;细胞培养至第三代,其形状逐渐呈较均匀的长梭形,流式细胞检测结果,证实该细胞群为CD90+CD44+CD45-的BMSCs细胞群。分离提取培养上清液中骨髓间充质干细胞分泌的BMSCs-exosomes,并经透射电子显微镜发现为圆形或椭圆形的小囊泡,直径30~100 nm,包膜完整且囊内含有低电子密度物质。结论:本部分实验成功获得稳定培养的骨髓间充质干细胞,并且经过分离提纯后获得高纯度的BMSCs-exosomes,为后续的体内动物干预实验做好准备。第二部分BMSCs来源的exosomes对大鼠急性胰腺炎损伤后修复作用目的:通过建立SD大鼠急性胰腺炎动物模型,观察BMSCs来源的exosomes能否减轻急性胰腺炎大鼠的病情,能否对其胰腺损伤具有保护或修复作用。方法:通过L-精氨酸腹腔注射的方法建立AP动物模型,将50只清洁级SD大鼠随机分为5组,每组10只:(对照组、AP组、PBS组、BMSCs组、BMSCs-exosomes组),观察各实验组大鼠指标血清淀粉酶、炎症因子TNF-α、IL-6及抑炎因子IL-10表达水平,胰腺组织、肺组织病理评分,胰腺细胞凋亡及凋亡调控基因Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果:AP组血清淀粉酶水平显著高于对照组(P0.05),表明成功建立大鼠胰腺炎模型;PBS组与BMSCs组和BMSCs-exosomes组血清淀粉酶相比较,差异显著(P0.05);BMSCs组和BMSCs-exosomes组相比较无明显差异(P0.05)。BMSCs-exosomes组、BMSCs组血清中TNF-α、IL-6、含量低于PBS组(P0.05);BMSCs-exosomes组、BMSCs组血清中IL-10含量高于PBS组(P0.05),BMSCs-exosomes组与BMSCs组血清中TNF-α、IL-6、IL-10相比较,差异无统计学意义(P0.05)。BMSCs组(7.30士0.79)、BMSCs-exosomes组(7.82士0.91)胰腺病理评分显著低于PBS组(10.31士0.85)(P0.05)。BMSCs组与BMSCs-exosomes组相比较,差异无统计学意义(P0.05)。AP组凋亡指数明显高于对照组(P0.05)。BMSCs组、BMSCs-exosomes组凋亡指数显著低于PBS组(P0.05)。BMSCs组与BMSCs-exosomes组相比较,差异无统计学意义(P0.05)与PBS组相比,BMSCs组与BMSCs-exosomes组胰腺基因Bax蛋白表达水平明显降低(P0.05),不论在PBS组还是BMSCs组与BMSCs-exosomes组,均有较弱的基因Bcl-2蛋白表达,各组动物相应时间点基因Bcl-2蛋白表达水平无显著差异性(P0.05)。结论:本部分实验通过腹腔分次注射L-精氨酸诱成功建立了急性胰腺炎大鼠动物模型,然后经过尾静脉注射分离纯化的BMSCs来源的exosomes,结果发现BMSCs-exosomes与BMSCs对急性胰腺炎有相似的治疗作用,都可能是通过抑制胰腺细胞的凋亡、促进细胞增殖的机制,从而对急性胰腺炎大鼠胰腺损伤发挥修复作用;并且同时通过调节促炎因子与抑炎因子的平衡,减轻炎症反应对组织器官细胞的损伤,起到保护器官功能的作用。由此,该结果为BMSCs-exosomes可完全替代BMSCs移植治疗急性胰腺炎提供一定的理论基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R576
【目录】：

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