FIAF在肠缺血再灌注多器官损伤中的核心作用研究

发布时间：2018-06-07 15:57

  本文选题：肠缺血再灌注 + 禁食诱导的脂肪因子　； 参考：《大连医科大学》2014年博士论文

【摘要】：肠缺血再灌注(Intestinal ischemia reperfusion, Ⅱ/R)损伤引发小肠屏障功能障碍并导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的病理过程是临床外科及重症监护室(Intensive care unit, ICU)常见的病理过程。有较高的死亡率和并发症率,而急性肠系膜栓塞导致的死亡率则高达60-80%。肠I/R引发的小肠屏障功能障碍是MODS发生发展过程中的关键环节。机械屏障是小肠屏障最为重要的组成部分。它是由小肠上皮细胞、紧密连接(tightjunction, TJ)和细胞间粘附分子构成的一个选择性的渗透性屏障。完整的肠屏障能有效阻止病原入侵并维持机体内环境稳定。炎症和氧化级联均能够破坏小肠屏障,新近的研究认为,过度活化的凋亡(apoptosis)与自噬(autophagy)也可直接破坏小肠屏障,而肌球蛋白轻链激酶(Myosin light-chain kinase, MLCK)调节的紧密连接信号则被认为是调控小肠屏障的关键因素。其中,紧密连接蛋白ZO-1和咬合蛋白(Claudin)-2在肠I/R损伤中呈现特殊性的分布和损耗。肺是肠I/R引起的远隔脏器损伤中最严重的器官之一,急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是肠I/R引起急性呼吸窘迫综合钲(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的中间环节。肠I/R破坏小肠屏障,导致菌群移位,炎性细胞因子及趋化因子等有害产物侵及淋巴途径,回流至胸导管导致肺脏损伤。该过程中,巨噬细胞活化是必不可少的。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AMs)参与肺泡微循环的破坏。活化的巨噬细胞还充当介质诱导中性粒细胞活化,释放多重炎性细胞因子及趋化因子等最终导致ALI。已有研究报道,抑制AMs减轻多种动物模型包括肺I/R模型导致的肺损伤。但是该观点存在争议,分子水平的信号机制仍未阐明。此外,肠I/R还可以导致远隔脏器如肝和肾等脏器的序贯性损害并最终导致MODS。因此,针对始动器官小肠进行干预至关重要。过去的研究认为,凋亡是小肠I/R后肠上皮细胞死亡的主要形式,进一步研究发现自噬也直接破坏小肠屏障。但是抑制细胞凋亡与自噬并不能完全逆转小肠I/R导致的多器官损伤。最新近的研究表明,坏死性凋亡(necroptosis)不仅参与小肠炎症性疾病,还导致系统性的炎症反应并增加小鼠死亡率。其确切调控机制并不清楚,但该通路是由TNF(α)与TNF受体结合所介导,并由受体相关蛋白-3(receptor-interacting protein 3, RIP3)、半胱天冬酶caspase-8与混合系列蛋白激酶样结构域样(mixed lineage kinase domain like, MLKL)蛋白三个关键分子所调节。该信号通路的活化不依赖于传统的细胞凋亡,也独立于经典的坏死途径。已有研究报道,雨蛙素诱导的急性胰腺炎中出现细胞坏死性凋亡现象。因此,坏死性凋亡可能在肠I/R引发的多器官损伤中具有重要价值。禁食诱导的脂肪因子(fasting-induced adipose factor, FIAF),又称血管生成素样因子4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4),是参与维持内环境稳态、创伤修复、细胞凋亡等过程的重要因子。FIAF可能在肠I/R多器官损伤中具有核心价值。首先,FIAF是可以由小肠绒毛上皮产生并分泌入血的一种分泌性蛋白。缺血或低氧可以诱导FIAF释放入血,FIAF还保护辐射诱导的小肠上皮细胞凋亡。FIAF维持血-脑屏障功能并调节ZO-1表达,降低渗透性。或许能维持肠屏障的完整性。其次,FIAF参与巨噬细胞介导的炎症反应,并在小肠淋巴系统的发育过程中是必不可少的。FIAF保护LPS诱导的肺微血管内皮细胞炎性损伤。FIAF缺陷加重高脂饮食诱发的小鼠肠系膜淋巴结的巨噬细胞的慢性重症炎症。而FIAF缺陷的小鼠由于小肠淋巴系统的发育不完整性在生后3周便出现免疫缺陷而死亡。这提示FIAF可能在淋巴途径介导的,并依赖于巨噬细胞活化的肠I/R肺损伤中具有重要价值。最后,FIAF抑制TNF-α的释放或可阻断肿瘤坏死因子与TNF受体结合,进而抑制RIP1和RIP3激活,恢复caspase-8的减少,同时抑制MLKL蛋白活性,最终抵抗细胞坏死性凋亡。据此,我们认为,FIAF在肠I/R所致肠屏障功能障碍多器官损伤中具有重要的核心作用,对其进行调控能有效改善肠屏障功能障碍所致的多器官损伤。直接诱导或者间接诱导FIAF均能改善肠道屏障功能,进而通过不同机制改善远隔器官的损伤。鱼油,主要成分为ωω-3多不饱和脂肪酸(Omega-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3PUFAs),已被广泛用于危重疾病包括肺疾病的治疗干预。临床应用鱼油的优点目前仍然存在争议。但已有研究表明ω-3PUFAs对I/R疾病具有保护作用。并且,ω-3PUFAs是FIAF的强诱导剂,可能抑制肠I/R肺损伤中巨噬细胞炎症反应。但也有研究认为,co-3PUFAs以AMPK/SIRT1通路依赖性的方式拮抗巨噬细胞炎症。因此,ω-3PUFAs可能通过AMPK/SIRT1通路和诱导FIAF减轻肠I/R肺损伤。天然生草本植物生源禅宁A(biochanin A, BCA)与姜黄同属多酚类化合物,也是PPAR活化剂并保护炎症、烧伤等危重疾病状态,可能诱导FIAF表达,并且多酚化合物姜黄抑制神经细胞的坏死性凋亡已有报道。因此,BCA可能诱导FIAF并抑制坏死性凋亡进而减轻肠I/R多器官损伤。基于此,本研究分别采用小鼠、大鼠建立肠I/R模型,并选择小肠上皮Caco-2细胞及人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)建立低氧复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)模型。采用western blot、real-time PCR、RNA干扰等先进分子生物学方法并加用PPAR抑制剂,先后探讨：一、FIAF在肠I/R小肠屏障功能障碍中的作用及机制。二、ω-3PUFA直接诱导FIAF抑制巨噬细胞炎症保护肠I/R屏障功能障碍肺损伤中的作用和机制。三、间接(生源禅宁A)诱导FIAF抑制坏死性凋亡进而保护肠I/R多器官损伤作用及机制。本研究将为FIAF在肠I/R多器官损伤中的作用提供理论依据,有利于实现科技成果转化。第一部分、Rh FIAF减轻肠I/R诱发的肠屏障结构和功能障碍目的：探讨FIAF在大鼠肠I/R引发的肠屏障功能障碍中的作用及外源性的应用人重组的FIAF对大鼠肠屏障功能障碍的保护作用及机制。方法：健康雄性Wistar大鼠24只,随机分为假手术组(Sham组)、肠I/R组(I/R+vehicle织.)、Rh FIAF组(I/R+Rh FIAF组)。Megison法构建小肠I/R模型,行肠系膜上动脉夹闭1h,再灌注4h。Rh FIAF组于再灌注起始给予尾静脉注射(RhFIAF 28mg/kg,溶于二甲基亚砜：dimethyl sulfoxide,DMSO),假手术组和肠I/R组给予相同剂量的溶媒(vehicle,0.1%DMSO)。观察小肠组织病理学变化,检测TNF-α、IL-6,lL-1β和MDA水平；自噬(Beclin-1、LC3I、LC3II和P62)与凋亡(Cleaved caspase-3/caspase-3)水平；屏障结构(MLCK、p-MLC/t-MLC、ZO-1和Claudin-2)和功能(FD4清除率及血管渗透性E-cadherin);小肠组织FIAF蛋白和mRNA变化。结果：1、与Sham组相比,I/R组：小肠绒毛排列紊乱、顶端断裂,粘膜及粘膜下间隙出血、水肿,上皮下间隙增宽；血清和小肠NF-α、IL-6、IL-1p(P0.01)、MPO及MDA水平升高(P0.05)；同时自噬(Bectin-1、LC3I、LC3II升高、P62降低)与凋亡(凋亡细胞数及Cleaved caspase-3/caspase-3升高)增加(P0.05)。屏障结构(MLCK、p-MLC/t-MLC增高；ZO-1、Claudin-2降低)和功能(FD4清除率增加及E-cadherin减少)削弱(P0.01)。小肠组织FIAF蛋白和mRNA表达增高(P0.05)。2、与1/R组相比,Rh FIAF组：小肠绒毛排列紊乱程度、顶端断裂、粘膜及粘膜下间隙出血及水肿程度均减轻,上皮下间隙无明显增宽；血清和小肠TNF-α、IL-6、IL-1p、MPO及MDA水平均下降(P0.05)：小肠自噬(Beclin-1、LC3I、LC3II降低、P62升高)与凋亡(凋亡细胞数与Cleaved Caspase-3)均降低(P0.05)。屏障结构(MLCK、p-MLC/t-MLC降低；ZO-1、Claudin-2增高)和功能(FD4清除率降低及E-cadherin增加)恢复(P0.01)。结论：1、肠I/R导致肠粘膜屏障和血管内皮屏障结构和功能破坏、加剧炎症级联和氧化应激、过度活化自噬与凋亡并降低生存率。2、人重组的FIAF保护肠I/R损伤诱导的肠屏障功能障碍,改善生存率。其机制可能是通过抑制肠上皮细胞的过度自噬与凋亡,减轻炎症和氧化级联；抑制MLCK通路进而调节ZO-1和Claudin-2表达,从而改善小肠屏障结构和功能。第二部分、o-3 PUFA直接诱导FIAF并活化AMPK/SIRT1通路减轻肠缺血再灌注肺损伤目的：活化的巨噬细胞的毒性产物通过淋巴系统侵及肺脏是肠I/R诱发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的最重要的发病机制。αω-3多不饱和脂肪酸(Omega-3polyunsaturated fatty acids,o-3 PUFAs)是针对巨噬细胞炎症的腺苷-5'-单磷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase/sirtuin1, AMPK/SIRT1)通路的强效激活剂,且能诱导FIAF表达,本研究探讨ω-3PUFAs是否可以通过AMPK/SIRT1通路或(和)诱导FIAF预防肠I/R所致的ALI。方法：使用雄性Wistar大鼠构建肠I/R模型,夹闭肠系膜上动脉60分钟后予以再灌注240分钟。鱼油乳剂(fish oil emulsion, FO,主要成分为ω-3 PUFAs)或生理盐水(对照组)1ml/d连续三天给予腹腔注射。再灌注结束时处死所有动物。收集血液和组织样品用于后续检测分析。结果：肠I/R引发严重的小肠和肺损伤,可见严重的肺组织水肿和巨噬细胞浸润。FO预处理维持了小肠和肺部微观结构的完整性。肠I/R诱导的巨噬细胞衍生的介质巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)和巨噬细胞趋化蛋白-1 (macrophage chemoattractant protein-1, MCP-1)、炎性标志物(NFκB,TNF-α,IL-6和IL-1 β)、以及促凋亡因子p66shc(P0.01,P0.01；P0.01,P0.05,P0.05,P0.05；P0.01)的表达增加。但AMPK, SIRT1和Claudin-5的表达下降并且FIAF表达升高(P0.01)。FO显著抑制肺组织巨噬细胞浸润,炎性标志物的表达和p66shc磷酸化(P0.01；P0.05；P0.05)。并且,FO还恢复了肺组织AMPK, SIRT1和Claudin-5的表达并进一步诱导了FIAF的表达增加(P0.01,P0.01,P0.05；P0.05)。结论：FO预处理可有效保护大鼠肠I/R引发肠和肺损伤,减少巨噬细胞浸润,抑制炎症反应,抑制肺细胞凋亡,且诱导FIAF表达：并以AMPK/SIRT1依赖的方式改善肠I/R后肺血管内皮屏障损伤。因此,研究和开发AMPK/SIRT1或(和)FIAF作为新的靶标对于肠I/R诱导的ALI患者的治疗具有重要意义。第三部分、 生源禅宁A诱导FIAF抑制坏死性凋亡途径减轻肠I/R多器官损伤目的：探讨FIAF调节的坏死性凋亡途径在肠I/R多器官损伤中的作用；生源禅宁A诱导FIAF抑制坏死性凋亡在肠I/R多器官损伤中保护作用及可能机制。方法：1、生源禅宁A对肠I/R多器官损伤的保护作用及机制研究。健康雄性C57BL/6J小鼠24只,随机分成以下三组：假手术组(sham组)；肠I/R组(I/R+vehicle组)；BCA预处理组(BCA组)。小肠I/R模型的构建同第一部分,BCA组在缺血模型构建前给予BCA50mg/kg/d腹腔注射,对照组给予相同剂量的DMSO,连续5天,再构建I/R模型。观察小肠及肝肺肾组织病理学变化；检测ALT、AST水平；BALFP含量；血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平；NF-α和IL-6水平,检测小肠坏死性凋亡(RIP3、MLKL和caspase-8); FIAF, PPARα、 PPARβ和PPARγ蛋白表达；FIAF mRNA表达。2、为明确BCA对Caco-2细胞H/R损伤的保护作用及其机制,采用小肠上皮Caco-2细胞建立H/R模型,采用BCA预处理、RNA干扰、不同PPAR亚型抑制剂干预,并采用MTT、western blot、real-time PCR等方法检测目的分子的蛋白和mRNA含量。筛选合适BCA浓度与作用时间后,先后探讨：1)、BCA通过不同PPAR亚型诱导Caco-2细胞FIAF mRNA表达。2)、FIAF蛋白和mRNA在Caco-2细胞不同时间H/R刺激后的表达。3)、BCA对H/R刺激引发的Caco-2细胞坏死性凋亡的抑制作用。4)、BCA对H/R刺激的Caco-2细胞FIAF蛋白和mRNA表达的影响。5)、FIAF在BCA减轻H/R刺激的小肠上皮细胞坏死性凋亡中的作用。结果：1、生源禅宁A对肠I/R损伤的保护作用及机制研究。(1)与假手术相比,I/R组：小肠炎细胞浸润,绒毛排列紊乱,粘膜及粘膜下见水肿、出血。肝细胞索紊乱,中央静脉及汇管区小血管瘀血、炎细胞浸润,肝血窦扩张、瘀血。肺泡严重充血,炎性细胞浸润,肺泡壁增厚,透明膜形成。肾小管明显扩张,上皮细胞肿胀,肾小球及球后毛细血管扩张,见红细胞渗出和炎细胞浸润,肾小球萎缩。肠肝肺肾组织病理学评分均升高(P0.01,P0.01,P0.05,P0.05)；ALT、AST；BALFP水平；BUN和Cr显著升高(P0.05)。血清TNF-α、IL-6;肠坏死性凋亡(RIP3、MLKL增加和Caspase-8降低)水平升高(P0.05,P0.05；P0.05,P0.05,P0.01)。肠FIAF mRNA和蛋白表达明显升高；PPARα和PPARγ蛋白表达显著升高；而PPARβ蛋白水平则降低(P0.05,P0.01；P0.05)。(2)与I/R组相比,BCA预处理组：小肠粘膜充血、间质出血减轻：粘膜缺损、断裂改善,腺体结构清楚：肝脏充血、水肿减轻,炎细胞减少。肺泡充血、炎细胞浸润减轻,未见透明膜,肺泡壁略厚。肾小管排列正常,轻度肿胀,肾小球肿胀破裂不明显,偶见少量破裂红细胞。肠肝肺肾组织病理学评分均降低(P0.05)。ALT、AST：BALFP水平；血BUN和Cr水平均降低(P0.05)。TNF-α、IL-6、小肠坏死性凋亡(RIP3、MLKL降低；Caspase-8升高)改善(P0.05)。肠FIAF mRNA和蛋白、PPARα和PPARγ水平进一步升高(P0.05)；而PPARβ蛋白水平则无明显升高(P0.05)。2、BCA对Caco-2细胞H/R损伤的保护作用及其机制研究(1)、BCA通过PPARα和PPARγ诱导FIAF mRNA表达(P0.05)。(2)、Caco-2细胞缺氧1h后,FIAF蛋白和mRNA在16h内呈现时间依赖性增高(P0.05)。(3)、H/R刺激使Caco-2细胞出现炎症反应和坏死性凋亡(P0.01)；BCA剂量依赖性的抑制炎症反应和坏死性凋亡(P0.05)。(4)、BCA能够使FIAF蛋白和mRNA在H/R刺激后应激性增高的基础上进一步增高(P0.05)。(5)、FIAF在BCA干预保护H/R刺激的Caco-2细胞中是必不可少的(P0.01)。结论：1、BCA可以保护肠I/R导致的多器官损伤。2、BCA诱导FIAF的表达是通过活化PPARα和PPARβ发挥作用的。3、BCA可以通过上调FIAF蛋白和mRNA的表达,抑制肠上皮细胞坏死性凋亡,进而发挥对肠I/R多器官损伤的保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574
，

本文编号：1991751