靶向调控核受体FOXO1预防胆固醇结石形成的可行性研究
发布时间：2018-06-25 18:09
本文选题：叉头转录蛋白O1 + 法尼醇受体 ； 参考：《江苏大学》2017年博士论文
【摘要】：叉头转录蛋白(Fox家族)是一组进化过程中保守的转录因子,有100个以上的成员,其在分化、增殖、凋亡、应激反应和代谢方面起着很重要的作用。业已发现,FoxO有FoxO1、Fox03、Fox04和Fox06,它们在哺乳动物的代谢和生长中起着关键的作用,而FoxO1则与代谢性疾病关系最为密切。近年来体外研究发现,FoxO1去磷酸化后,从细胞质内转入细胞核内,启动下游靶基因的转录,是胰岛素抵抗发生的关键因素,并可能影响肝脏中胆固醇向胆囊的转运。在代谢研究中发现,FoxO1在肝脏内的过表达会增加甘油三酯的蓄积和减少脂肪酸的氧化。而流行病学研究表明,高胆固醇血症与胆石症并无正相关性,而与高甘油三酯血症有关。因此,FoxO1在肝脏的过表达,可能就是胆固醇结石形成的机理所在。代谢综合征状态下,FoxO1的下游分子具有影响脂质代谢和糖代谢的作用,其影响过程在于FoxO1的去磷酸化状态。生理浓度的胰岛素抑制FoxO1,导致刺激Cyp7a1基因转录,继而增加胆汁酸的合成。基于以上理论,本课题的研究通过体外FoxO1过表达及下调等途径,分析研究其下游调节胆石成因相关基因的表达;并应用重组FoxO1或发夹小干扰RNA病毒,建立成年小鼠的体内FoxO1过表达或下调的模型,以期揭示FoxO1与胆固醇结石形成的直接分子机制。目的:应用慢病毒感染技术构建稳定过表达FOXO1的HepG2细胞株,利用RNA干扰技术构建稳定低表达FOXO1的HepG2细胞株,观察脂质代谢、转运相关基因的表达情况。构建小鼠FoxO1基因shRNA重组腺病毒载体和FoxO1基因过表达重组腺病毒载体,并经C57BL/6小鼠体内应用,分析FoxO1基因参与胆固醇结石形成的机制,探讨靶向调控核受体FOX01预防胆固醇结石形成的可行性。方法:一.FOXO1对人肝细胞基因转录调控的体外研究(一)FOXO1基因的克隆:应用PCR技术从人肝组织克隆FOXO1基因,选用pEZ_Lv203慢病毒作为载体,借助测序以鉴定结果。(二)shRNA干扰靶点序列的设计与合成:针对目的基因人FOXO1序列,利用软件设计并合成三对shRNA干扰靶点序列,送吉玛生物科技(上海)有限公司合成,测序鉴定结果。(三)过表达FOXO1的HepG2细胞株的建立1.构建人FOXO1基因过表达重组慢病毒载体:利用PCR技术从人肝组织克隆FOXO1基因,选用pEZ_Lv203慢病毒载体,送广州复能公司合成、包装并纯化pEZ-FOXO1 慢病毒。2.稳定过表达FOXO1的HepG2细胞株的筛选与鉴定:(1)包装好FOXO1过表达重组慢病毒感染HepG2细胞,72小时收集细胞,提取RNA和蛋白;实时荧光定量PCR检测FOXO1mRNA的表达情况,Western Blot检测FOXO1蛋白表达情况(2)用1.0 μg/mL的嘌呤霉素筛选慢病毒感染的HepG2细胞株,96小时后收集细胞,提取RNA的蛋白;实时荧光定量PCR检测FOXO1 mRNA的表达情况,Western Blot检测FOXO1蛋白表达情况。(3)培养、收集过表达FOXO1的HepG2稳定细胞株,提取总RNA和蛋白;实时荧光定量PCR检测各基因mRNA的表达,对mRNA表达有差异的基因,用Western Blot检测其蛋白的表达。(五)稳定低表达FOXO1的HepG2细胞株的建立1.构建人FOXO1基因shRNA重组慢病毒载体:针对目的基因人FOXO1序列,利用软件设计并合成三对shRNA干扰靶点序列,送吉玛生物科技(上海)有限公司合成、包装并纯化FOXO1 shRNA干扰慢病毒。2.稳定低表达FOXO1的HepG2细胞株的筛选与鉴定:(1)包装好FOXO1shRNA干扰慢病毒感染HepG2细胞,96小时后收集细胞,提取RNA和蛋白;实时荧光定量PCR检测FOXO1 mRNA的表达情况,Western Blot检测FOXO1蛋白表达情况。(2)用1.0 μg/mL的嘌呤霉素筛选慢病毒感染的HepG2细胞株,96小时后收集细胞,提取RNA的蛋白;实时荧光定量PCR检测FOXO1的mRNA,Western Blot检测FOXO1蛋白表达情况。(3)培养、收集低表达FOXO1的HepG2稳定细胞株,提取总RNA和蛋白;实时荧光定量PCR检测各基因的mRNA。对mRNA表达有差异的基因,用Western Blot检测其蛋白的表达情况。(六)实时荧光定量PCR (qRT-PCR):根据PAXgeneRNAkit操作说明书提取细胞总RNA,琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100检测RNA完整性。按照ABI逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。按照ABIlifetechTaqman基因表达分析体系说明书在ABI7900上检测基因表达。扩增后结果采用2-△△Ct法对检测结果进行分析。(七)Western Blot:收集细胞,加入细胞蛋白裂解缓冲液,采用超声破碎细胞。采用BCA法检测蛋白浓度。稀释至相同浓度后上样,5%浓缩胶电泳80V 30 min,换120V,10%分离胶继续电泳60min。400mA转膜120min; 5%脱脂牛奶封闭两小时后,加一抗过夜;二抗孵育2h,显影拍照。采用ImageJ分析软件分析结果。二、Fox01基因与胆固醇结石形成的体内研究(一)FoxO1基因的克隆:利用PCR技术从小鼠肝组织克隆FoxO1基因,选用PDC316-MCS2腺病毒载体,构建穿梭质粒M_3_3Flag-FoxO1,利用测序、Western Blot方法进行结果鉴定。(二)shRNA干扰靶点序列的设计与合成:针对目的基因FoxO1序列,利用软件设计并合成三对shRNA干扰靶点序列,送吉满生物科技(上海)有限公司合成,分别插入载体PGMAV-S1腺病毒载体,利用测序、Western Blot方法进行结果鉴定。(三)采用AdMax系统包装腺病毒,CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒,梯度稀释法检测病毒滴度。(四)动物分组与处理:将40只C57BL/6小鼠随机分为四组,分别经尾静脉注射对FoxO1基因的shRNA腺病毒(FOXO1-shRNA组)、针对FoxO1基因的shRNA空白载体组(shRNA对照组)、FoxO1基因过表达腺病毒(FOXO1-OE组)、FoxO1基因过表达腺病毒空白载体组(FOXO1-OE对照组),给予胆固醇成石饲料喂养。FoxO1干扰对照组及FoxO1干扰组喂养6周,FoxO1过表达对照组及FoxO1过表达组喂养4周后处死。处死前禁食12小时,自由饮水。(五)检测标本留取:上述各组小鼠用戊巴比妥(4.5mg/100g体质量)腹腔注射麻醉,眶周静脉取血,离心取血清-80℃保存。采用腹部正中切口,暴露胆囊,观察有无结石,结扎胆囊管切除胆囊于液氮冻存。采集肝脏冻于-80℃保存至检测。(六)胆汁中胆固醇、磷脂和胆汁酸的测定:取20 μL胆汁,加入180μL生理盐水稀释10倍,罗氏ModularP全自动生化检测仪检测。利用Carey表计算胆固醇饱和指数(Cholesterol saturation index,CSI)。(七)荧光定量PCR检测C57BL/6小鼠肝脏脂类代谢转运相关基因的表达变化,对于mRNA表达有差异的基因,用Western Blot检测其蛋白的表达情况。结果:1.筛选出稳定低表达FOXO1及过表达FOXO1的细胞株各一株(1)筛选的shRNA慢病毒命名为LV3-FOXO1-shRNA2。在RNA水平:感染72小时及96小时,相对于空白对照的相对表达量为0.17和0.19;在蛋白水平:感染72小时及96小时,相对于空白的相对表达量为0.899和0.848。而过表达慢病毒pEX-FOXO1,在RNA水平:感染72小时及96小时,相对于空白相对表达量为8.94和6.17;在蛋白水平:感染72小时及96小时,相对于空白相对表达量为0.027和1.400。(2)筛选培养96小时后,LV3-FOXO1-shRNA2 mRNA表达为空白对照的0.527(n=3,P0.05),蛋白表达为空白对照的0.62 (n=3,P0.05) ; pEX-FOXO1mRNA表达为空白对照的105.10 (n=3, P0.05),蛋白表达为空白对照的2.01 (n=3,P0.05)。2. FOXO1对CYP7A1及FXR基因表达的影响FOXO1基因低表达时,CYP7A1基因表达上调约4倍(t==21.03, P0.01),FXR基因上调约1.4倍(t=3.047,P0.05) ; FOXO1高表达时,CYP7A1基因表达下调约4倍(t=21.85, P0.01),FXR基因下调约0.8倍(t=12.62, P0.05),具有统计学意义。3.成功构建FoxO1过表达及FoxO1低表达腺病毒载体(1) FoxO1过表达腺病毒载体转染293T细胞培养48 h后提取蛋白。Western Blot检测结果显示构建载体能在293T细胞表达,提示载体构建成功。(2)构建的三个FoxO1 shRNA干扰腺病毒感染鼠ST2细胞,培养72 h,提取总蛋白。根据Western blot结果选择干扰效果最好的,继续扩增,用于后续实验。(3)扩增构建的腺病毒滴度结果:获得滴度为1X1011 PFU/mL的FoxO1过表达(FoxO1-OE)和FoxO1干扰(FoxO1-shRNA)腺病毒。4.体内干预试验结果(1) FoxO1过表达组及FoxO1过表达对照组,致石饮食喂养4周后,麻醉处死,观察胆囊成石情况,取标本。FoxO1过表达对照组,4只成石(4/10),成石率40%;FoxO1过表达组,8只成石(8/10),成石率80%。FoxO1干扰组组及FoxO1干扰对照组,致石饮食喂养6周后,麻醉处死,观察胆囊成石情况,取标本。FoxO1干扰对照组,10只成石(10/10),成石率100%; FoxO1干扰组,2只成石(2/10),成石率20%。(2)与对照组相比,FoxO1干扰组胆囊胆汁总胆固醇明显下降,总胆汁酸明显升高,CSI明显降低,具有统计学意义。磷脂变化没有统计学意义,呈降低趋势。而FoxO1过表达组各指标变化呈相反趋势。(3)小鼠血清的血脂检测结果显示:与FoxO1干扰对照组相比,FoxO1干扰组小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL水平均下降,差异有统计学意义。TG、GLU及HDLC则没有明显差异。相对于FoxO1过表达对照组,FoxO1过表达组小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL均升高,差异具有统计学意义。TG、GLU没有明显差异。(4)基因相对表达量检测结果显示:与对照组相比,FoxO1干扰组的基因Cyp7a1和Fxr表达明显升高。而FoxO1过表达则呈相反结果。在FoxO1干扰的抗结石组我们发现,Cyp7b1、Cyp8b1和Cyp27a1与对照组相比均呈上升趋势,其中Cyp8b1升高明显,具有统计学意义。(5)蛋白免疫印迹实验显示:与对照组相比,FoxO1干扰组的蛋白Cyp7a1和Fxr表达明显升高。而FoxO1过表达组则呈相反结果。这一结果与基因研究结果相一致。结论:1.成功构建FOXO1低表达和高表达慢病毒载体。感染HepG2后,筛选出低表达FOXO1和高表达FOXO1的稳定细胞株,构建了细胞模型。2.构建了FoxO1低表达和高表达腺病毒载体,经尾静脉注射C57BL/6小鼠,成功复制出低表达FoxO1和高表达FoxO 1的小鼠模型。3.随着FOXO1基因表达水平的变化,CYP7A1和FXR基因的表达水平发生改变,而ABCG5、ABCG8、ABCB11等脂质转运基因没有相应的改变。提示,FOXO1基因可能通过影响胆固醇和胆汁酸的代谢而参与胆固醇结石的形成。体内干预试验结果也显示,FoxO1在小鼠体内过表达时具有一定的促成石作用。FoxO1的shRNA干扰腺病毒,在小鼠具有明显的抗成石效果。提示FoxO1作为预防和治疗胆囊胆固醇结石靶点的可行性。4.进一步的机制研究发现,当FoxO1基因表达发生变化时,引起Cyp7a1和Fxr基因的表达改变,而Abcg5、Abcg8、Abcb11等脂质转运基因没发生相应的改变。提示,FoxO1基因可能通过影响胆固醇和胆汁酸的代谢而参与胆固醇结石的形成。FoxO1低表达时,Cyp8b1表达增高,表明抑制FoxO1可能提高胆囊胆汁中胆酸和脱氧胆酸比例,从而促进胆固醇的溶解。这也可能是其抗成石的机制之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.62
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 刘清;金俊哲;吕洪洋;邢保健;;胆囊结石的相关危险因素分析[J];中国普外基础与临床杂志;2016年12期
2 杨琳珊;占贞贞;汪波;杨s，
本文编号：2067005
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