CRF调控肥大细胞在肠易激综合征发病中的机制研究

发布时间：2018-07-01 17:04

本文选题：肠易激综合征 + 促肾上腺素皮质激素释放因子　；参考：《郑州大学》2017年博士论文

【摘要】：肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是消化内科最常见的慢性复发性胃肠道疾病,以罗马III标准为诊断标准,IBS的全球发病率为1.1%到29.2%[1]。IBS的主要特征是腹痛、腹部不适,伴有排便习惯的改变。患者症状迁延起伏,生活质量显著下降,使得IBS成为一个重要的公共卫生问题。它的发病机制不完全明确,有多个系统参与其中,比如脑-肠轴调节异常、肠道屏障功能障碍、内脏高敏感性、肠道运动功能异常等,而心理应激、食物不耐受、肠道感染是重要的诱发因素[2]。有部分IBS患者的症状是由焦虑、紧张、愤怒、恐惧等心理应激(stress)所诱发[3]。应激作为对机体内部稳态的一种威胁,能够导致脑-肠轴调节功能异常,进而引起一系列广泛的胃肠道效应,最终导致IBS的发生。应激反应中所释放的促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor,CRF)是重要的调节介质,它是一种41氨基酸肽,可由中枢神经系统和外周组织产生。人体的胃肠道中普遍有CRF的表达,与中枢CRF的作用方式不同,肠道中神经内分泌细胞和免疫细胞释放的外周CRF可直接激活免疫细胞,在局部发挥促炎作用或作用于内脏神经末梢[4]。CRF的活性是通过与效应细胞上CRF受体CRF-R1或/和CRF-R2受的结合来介导的,它们是特殊的七次穿膜的G蛋白偶联受体[5,6],应激反应可以导致其在肠道的表达异常[7]。研究发现,IBS患者肠道组织中,有CRF上调的现象[8];而避水应激、束缚应激均可导致小鼠出现肠道运动异常和内脏高敏感性,结肠组织中也存在外周CRF升高的现象[9,10]。所以CRF是导致IBS的发生的关键效应因子。近年来,肥大细胞在IBS发病机制中的作用逐渐受到研究者们的关注[11]。在IBS患者的肠道的各部位均可以观察到肥大细胞的增殖[12-15]。肥大细胞属于肠道固有免疫系统,与肠道的主要功能关系密切,可以调节肠道屏障功能、上皮细胞的分泌功能、肠道的血供、神经-免疫系统的相互作用、内脏的敏感性以及肠道的运动功能等[15]。若肠道中的肥大细胞发生增殖和活化,其释放的各种细胞因子、趋化物质和蛋白酶,可激活神经-免疫系统,导致内脏高敏感性、肠道运动功能的异常、肠道屏障功能的异常以及内分泌功能的异常,最终可能导致患者出现腹痛、腹胀、腹泻或/和便秘等IBS的症状[17]。肠道有大量的共生菌群(commensal microfla),也称为原籍菌,定植于肠上皮细胞的表面,一些细菌的成分比如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖、细菌产生的超抗原、细菌的Cp G-DNA序列、热休克蛋白等都有激活免疫细胞的作用[17]。为了维持免疫稳态,生理状态下,作为暴露于肠内细菌的第一线,肠道上皮细胞及肠道免疫细胞对共生菌群均处于一种免疫耐受的状态。其中,对LPS产生的耐受被称为内毒素耐受(endotoxin tolerance,ET)。在这个调控机制中,模式识别受体Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)发挥了重要的作用。其中,TLR4是LPS的受体,研究表明,结肠上皮细胞、肠道巨噬细胞的内毒素耐受可能是通过下调TLR4的表达来实现的[18-20]。细胞因子信号抑制蛋白(suppressors of cytokine signaling,SOCS)家族在维持内毒素耐受的过程中也发挥了重要的作用[21]。肥大细胞作为脑-肠轴的重要的效应细胞在消化道黏膜广泛分布,同时又处于与共生菌群接触的第一线,其TLRs信号途径经过精心调控,维持着内毒素耐受。那么,当肥大细胞的内毒素耐受被打破,原本对LPS的低反应状态发生改变,必将激活下游的效应系统,引起肠道免疫系统的激活,导致内脏高反应、肠道屏障功能障碍及肠道运动的异常。我们团队的研究显示,CRF可调控上皮细胞上TLR4的表达,从而打破其对LPS的耐受[22]。肥大细胞表达有CRF的受体CRF-R1和CRF-R2,同时还表达TLR4,那么CRF是否能够打破肥大细胞细胞的内毒素耐受是一个值得探讨的问题。肠道屏障主要由微生物屏障、粘液层、肠道上皮细胞层、黏膜下层的淋巴细胞和固有免疫细胞等构成,发挥着双重的作用:一方面要从肠道的食物中吸收营养;一方面要选择性的控制肠腔内的食物抗原、肠道原籍菌及其活性成分进入肠道固有免疫系统、产生免疫反应。所以,肠道屏障功能在维持肠道正常生理功能和免疫稳态中具有至关重要的作用。肠道屏障功能障碍是指肠黏膜的通透性发生持续的升高,导致肠道免疫稳态失衡、功能受损和疾病发生[23]。许多IBS的患者中存在着肠黏膜通透性增高的情况,这可能会导致肠道内共生菌的某些成分和大分子食物抗原进入并激活肠道免疫系统,导致各种活性物质的释放,患者出现IBS的症状[24,25]。虽然目前导致IBS患者肠道屏障功能障碍的机制并不明确,但很多研究者认为这种现象与肠道的低度炎症有关,是由促炎因子的持续作用所导致,而肠道的低度炎症又与活化的肥大细胞的数量呈正相关[26,27]。激活的肥大细胞所释放的的肥大细胞蛋白酶(mast cell protease,MCP)类物质和TNF-α能够导致肠黏膜通透性增高[28]。但若肥大细胞对LPS的内毒素耐受能够被打破,LPS-TLR4途径的细胞因子是否能够影响肠道屏障功能尚需探讨。综上所述,应激反应中释放的CRF是IBS病理生理过程中最重要的效应因子,肥大细胞是肠黏膜免疫系统中重要的固有免疫细胞,肠道屏障功能障碍是IBS发病的关键环节。正常生理条件下,肥大细胞保持着对LPS的内毒素耐受。那么,CRF是否能够调控肥大细胞打破其对LPS的内毒素耐受,进而引起肠道屏障功能障碍,通过什么机制导致肠道屏障功能障碍,是本研究旨在探讨的问题。希望通过本研究能够进一步阐明IBS的发病机制,为IBS的治疗寻找新的证据,探索新的前景。第一部分CRF调控肥大细胞打破内毒素耐受的机制研究目的:肥大细胞表达有CRF的受体CRF-R1和CRF-R2,CRF可以通过与二者结合诱导肥大细胞脱颗粒,释放出MCP和TNF-α。但CRF是否能够通过调控肥大细胞表面的TLR4受体、以及SOCS系统来打破肥大细胞对LPS的内毒素耐受,最终合成释放LPS-TLR4途径的细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-13和TNF-α),目前尚不明确。本研究在体外用LPS诱导HMC-1肥大细胞建立内毒素耐受,再用CRF对内毒素耐受的肥大细胞进行干预,了解CRF是否能够调控肥大打破其对LPS的内毒素耐受,并阐明其相关机制。材料与方法:1.用不同浓度的LPS(0、10、100ng/mL)预处理HMC-1肥大细胞,再以100ng/m L的LPS进行激发,透射电镜观察各组细胞脱颗粒的情况,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α、MCP,IL-1β、IL-6以及IL-13的水平。2.在成功诱导针对LPS内毒素耐受的基础上,用不同剂量的CRF(0,50,100 pg/m L)作用于耐受的肥大细胞,观察其对肥大细胞表面TLR2、TLR4 m RNA和蛋白表达的影响。为了了解这种调控作用是通过CRF与CRF-R1或/和CRF-R2结合,在细胞内是以Erk1/2还是以p38 MAPK信号途径转导,分别以不同的拮抗剂在CRF干预前进行预处理。收集各组细胞,提取总m RNA和总蛋白,进行Realtime-PCR和Western blotting的检测。3.为了解TLR4是否CRF打破肥大细胞内毒素耐受的中心环节,设计合成sh RNA,构建慢病毒载体对HMC-1肥大细胞进行转染,对HMC-1肥大细胞的TLR4基因进行基因沉默。4.将按步骤2中处理的各组细胞及TLR4 null的细胞,予以100ng/mL的LPS激发,透射电镜观察各组细胞脱颗粒的情况,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α、MCP,IL-1β、IL-6以及IL-13的水平,以了解各组细胞的内毒素耐受是否被打破。5.在成功诱导针对LPS内毒素耐受的基础上,分别以(0,100pg/ml)浓度的CRF处理内毒素耐受的肥大细胞,并设置以CRF拮抗剂预处理的CRF-anta组,后予以LPS激发,收集细胞进行Realtime-PCR和Western blotting的检测SCOS-1和SCOS-3 m RNA和蛋白的表达。结果1.在体外以100ng/m L浓度的LPS预处理的HMC-1肥大细胞,再次以100ng/m L的LPS激发后,较未诱导耐受的naive细胞相比,其释放的TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-13的水平显著下降(P0.05),MCP的水平则无显著差异(P0.05)。各组细胞均未发生脱颗粒现象。提示内毒素耐受成功建立。2.以不同浓度的CRF处理内毒素耐受的HMC-1肥大细胞,发现相对于对照组,100pg/ml的CRF可以显著上调肥大细胞表面的TLR4 m RNA和蛋白的表达(P0.05),这个作用可以被CRF-R1和Erk1/2的拮抗剂所解除。各组细胞间TLR2m RNA和蛋白的表达没有统计学差异(P0.05)。3.设计合成sh RNA,构建慢病毒载体对HMC-1肥大细胞进行转染,对TLR4基因进行基因沉默,成功构建了TLR4 null的肥大细胞。4.按步骤2中处理的各组细胞及TLR4 null的细胞,予以LPS激发,发现100pg/ml的CRF有双重作用:它可以引起HMC-1肥大细胞发生脱颗粒反应,释放MCP和TNF-α;同时,它可以打破肥大细胞的内毒素耐受,释放IL-1β、IL-6、IL-13和TNF-α。CRF诱导肥大细胞脱颗粒的作用可以被CRF-R1和CRF-R2拮抗剂所解除;而CRF打破内毒素耐受的作用,可以被CRF-R1和Erk1/2的拮抗剂所解除。TLR4 null的细胞,既不能建立对LPS内毒素耐受,也不能被CRF诱导打破耐受。5.对内毒素耐受的肥大细胞予以100pg/ml的CRF处理,相对于对照组,其信号抑制蛋白SCOS-1和SCOS-3 m RNA和蛋白的表达显著下降(P0.05),这种作用可以被CRF受体拮抗剂所阻断。结论:CRF可以通过两种途径激活肥大细胞:一是与肥大细胞上的CRF-R1和CRF-R2结合,直接引起肥大细胞脱颗粒,导致MCP和TNF-α释放。二是与肥大细胞上的CRF-R1结合,通过细胞内的Erk1/2信号转导途径,上调肥大细胞表面TLR4的表达;同时,下调了对LPS-TLR4-NFκB通路有抑制作用的细胞因子信号抑制蛋白SCOS-1和SCOS-3的表达,最终导致肥大细胞对LPS的内毒素耐受被打破,LPS-TLR4途径的细胞因子IL-1β、IL-6、IL-13和TNF-α释放。第二部分CRF调控肥大细胞导致肠道屏障功能障碍的机制研究目的:肠道屏障功能障碍会导致肠黏膜通透性增高,肠道内共生菌的某些成分和大分子食物抗原进入并激活肠道免疫系统,导致患者出现IBS的症状。上皮细胞间的紧密连接蛋白和细胞膜上表达的某些离子通道蛋白(比如TWIK-related potassium channel-1,Trek1)对于维持肠道屏障功能有重要作用。目前,CRF激活肥大细胞引起肠道屏障功能障碍的机制不完全明确,尤其是CRF调控肥大细胞打破内毒素耐受后,LPS-TLR4途径所释放的细胞因子引起肠道屏障功能障碍的机制尚不清楚,是本研究旨在解决的问题。材料与方法1.6-8周龄Balb/c小鼠40只,分为对照组(Control组)、避水应激组(Stress组)、假避水组(Sham组)、CRF拮抗剂(CRF-anta组)、肥大细胞稳定剂(MC stabilizer组),分别给予不同的干预后,按照避水程序进行避水。Control组不避水,Sham组水槽中不加水。第10天避水结束后处死小鼠,取血清及结肠组织。新鲜组织进行尤斯室实验;另取组织用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋、切片,行HE染色和免疫荧光检测;留取组织冻存于-80℃低温冰箱,待行Real time-PCR和Western blotting检测。2.ELISA法检测各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-13、TNF-α和MCP的水平。3.将新鲜结肠组织剥离浆膜层和肌层,放入尤斯室后平衡30分钟,待短路电流(Isc)稳定后,使用数据采集软件,每30分钟在尤斯室中记录跨膜电导G、短路电流Isc,共2小时。以HRP(44k D)作为蛋白探针模型用于检测黏膜对大分子物质的通透性变化,以HRP回收率(HRP%)表示黏膜对HRP的通透性。4.分别提取结肠组织的总RNA和总蛋白,Realtime-PCR和Western blotting法检测claudin5,7,8,12,15和Trek1 m RNA和蛋白的表达。5.免疫荧光法检测Trek1蛋白在结肠组织中的表达。6.将人结肠上皮细胞系T84细胞接种于Transwell系统内,制备单层细胞层,分别加入CRF激活肥大细胞后释放的细胞因子IL-1β,IL-6,IL-13,MCP或TNF-α,观察它们对T84上皮细胞层Trek1 m RNA和蛋白的影响。结果:1.ELISA法对各处理组小鼠血清中的MCP、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-13水平进行检测,发现Stress组小鼠血清中5种细胞因子的水平显著高于其它4组(P0.05),其它4组间差异无统计学意义。2.尤斯室中测得Stress组小鼠的G、Isc以及HRP回收率均显著高于Control组和Sham组(P0.05);而CRF-anta组和MC stabilizer组G、Isc以及HRP回收率均显著低于Stress组(P0.05),与Control组和Sham组相比则无统计学差异(P0.05)。提示在应激反应下,小鼠结肠黏膜的通透性增高,但这种作用可以被CRF受体拮抗剂和肥大细胞稳定剂所拮抗。3.结肠组织的HE染色提示相较于对照组和假避水组,Stress组结肠上皮细胞排列紊乱,上皮细胞间的间隙变大。而CRF拮抗剂和肥大细胞稳定剂组小鼠的结肠HE染色与对照组和假避水组相比,结构相似,无明显的差异。4.对各组小鼠结肠组织进行Trek1和Claudin5,7,8,12,15m RNA和蛋白检测,结果显示各组间Claudin5,7,8,12,15m RNA和蛋白表达差异无统计学意义。而Trek1 m RNA和蛋白的表达水平在各组间有差异,Stress组的Trek1 m RNA和蛋白显著低于其他4组(P0.05),提示应激小鼠结肠组织中Trek1 m RNA和蛋白显著降低,但经过CRF受体拮抗剂和肥大细胞稳定剂干预后,Trek1 m RNA和蛋白的水平可恢复。5.用免疫荧光法检测各组小鼠结肠组织中的Trek1蛋白的表达(用FITC标记的绿色荧光表示),与m RNA和蛋白的检测结果一致,Stress组小鼠结肠的Trek1蛋白的荧光强度显著低于其他4组。6.IL-1β,IL-6,IL-13,MCP或TNF-α干预T84上皮细胞层后,Trek1 m RNA和蛋白的表达均显著低于对照组(P0.05)。由于这几种细胞因子都可以激活P38MAPK途径,我们重复了上述实验过程,在培养液中预先加入了p38抑制剂,发现进行了这几种细胞因子对Trek1 m RNA和蛋白的抑制作用被解除。结论:CRF可调控肥大细胞导致避水应激的小鼠肠黏膜透性增高,这种作用是通过CRF激活肥大细胞所释放的细胞因子IL-1β,IL-6,IL-13,MCP和TNF-α通过p38MAPK途径抑制结肠上皮细胞中Trek1的表达实现的。第三部分双孔钾离子通道蛋白Trek1对肠道屏障功能的调节作用目的:肠道屏障功对于维持全身的免疫稳态有着重要的意义。然而,导致IBS患者肠道屏障功能障碍的机制并不完全明确,改善肠道屏障功能的治疗方法也很有限。双孔钾离子通道Trek1蛋白定位于上皮细胞和血管内皮细胞,在肺泡上皮细胞、心血管内皮细胞和肠上皮细胞均有表达。近期研究表明Trek1能够调整肺泡上皮屏障功能、血脑屏障功能、神经-免疫细胞屏障功能。在第二部分研究中,我们发现Trek1的表达下调的结肠黏膜的通透性增加,推测Trek1的表达可以调节肠道屏障功能。在本研究中,将进一步探讨Trek1与肠道屏障功能的关系。材料与方法:1.体外培养肠上皮系T84细胞,待细胞生长状况良好将其以106 cells/ml的浓度将三组细胞接种于的Millpore Transwell系统的insert(无包被,滤孔直径为0.4μm)中制作单细胞层。每日用Millicell-ERS的欧姆仪检测T84单层的跨膜电阻TER,当TER大于1000?/cm~2时,开始进行后续的实验。2.使用sh RNA法,对T84细胞进行基因沉默。设空载质粒对照组csh RNA和PBS处理的Medium组。3.使用Millicell-ERS欧姆仪分别于0h、8h、16h、2d、3d、4d、5d、6d、7d这9个时间点记录各组单细胞层的TER值。4.将HRP以10-5mol/L的浓度加入上室,30分钟后分别收集上室和下室的细胞培养液,检测HRP酶的活性。对HRP的通透性以HRP回收率(HRP%)表示。5.在基因沉默的T84单层细胞中按照0,10,100,1000nmol/L的浓度梯度加入重组蛋白r Trek1。设立以无关蛋白BSA处理的阴性对照和无任何处理的wild组作为阳性对照。分别检测各组单层细胞的跨膜电阻TER和HRP%。结果:1.对T84细胞分别进行shRNA、阴性对照(cshRNA)以及中性缓冲液PBS(medium)处理,Western blotting的结果提示在进行sh RNA转染处理的0-7天中,T84单层细胞中Trek1蛋白的表达从第1d开始下降,到第2d显著下降,始终维持在很低的水平,一直到7d,提示我们sh RNA操作是成功的。灰度分析显示sh RNA组中Trek1蛋白的表达水平(β-actin%)显著低于csh RNA及medium组(P0.05)。2.对T84细胞的Trek1基因进行沉默后,T84单层上皮细胞层的TER从第16h开始下降,到第48h显著下降,并且一直维持较低的水平至第7天,从第16h到第7d,sh RNA组中T84单层细胞跨膜电阻TER始终显著低于csh RNA及medium组(P0.05)。3.在对T84细胞的Trek1基因进行沉默后,HRP%从第16h开始升高,到第48h显著升高,并且一直维持较高的水平至第7天,从第16h到第7d,sh RNA组中T84单层细胞对HRP的回收率HRP%始终显著高于csh RNA及medium组(P0.05)。4.经100n M、1000n M r Trek1处理的Trek1 null T84细胞,其单层细胞跨膜电阻TER均显著高于0n M,10n M r Trek1处理组和BSA处理组(P0.05),提示再加入重组的r Trek1后,基因沉默引起的T84单层细胞跨膜电阻TER恢复正常。5.经100nM、1000n M r Trek1处理的Trek1 null T84细胞,其单层细胞对HRP通透性(HRP%)均显著低于0n M,10n M r Trek1处理组和BSA处理组(P0.05),提示再加入重组的r Trek1后,基因沉默引起的T84单层细胞对HRP通透性升高的现象显著改善。结论:结肠上皮细胞表达Trek1,体外将T84细胞的Trek1基因进行沉默可导致肠上皮屏障的通透性增高,再加入重组的r Trek1蛋白则可恢复肠上皮屏障功能。提示Trek1对维持正常的肠道屏障功能有重要的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574.4

【参考文献】