内皮素受体在人食管下括约肌的表达及调节机制的研究

发布时间：2018-07-05 07:59

本文选题：内皮素受体 + 套索纤维　；参考：《河北医科大学》2014年博士论文

【摘要】：食管胃结合部（Esophageogastric junction, EGJ）一束约2-3cm宽、特殊增厚的环形肌肉被称为食管下括约肌(Lower esophageal sphincter,LES)。Liebermann-Meffert在1979年第一次提出了人LES是由位于胃小弯侧的钩状纤维(clasp fibres)与胃大弯侧套索纤维（sling fibers）共同构成。斜行的套索纤维，半环形的钩状纤维与膈脚一起，在包括神经、体液等多种因素的共同作用下保持持续的收缩状态，因此EGJ形成了一个高压带，从而EGJ发挥了生理性抗返流屏障的作用，能够有效地防止胃向食管的返流。在中枢神经系统的支配下，食管下括约肌收缩和舒张功能的调节由多种神经递质、激素及自身肌源性因素共同完成。以往的研究发现，迷走神经末梢与食管下括约肌的肌层肠道运动神经元构成了调节食管下括约肌收缩和舒张的神经通路，即兴奋性迷走神经通路和抑制性迷走神经通路。节前、节后胆碱能运动神经元二者共同构成了兴奋性运动传导通路。而抑制性运动传导通路则由节前胆碱能运动神经元与节后非胆碱能非肾上腺素能神经元（Nonadrenergic Noncholinergic, NANC）二者共同构成。上述两种神经通路激活后引起胆碱能节后神经元或者肠道神经元各种神经递质的释放。通过这些神经递质的释放，从而实现了神经对食管下括约肌收缩、舒张的调节。根据既往科研结果，目前研究比较明确的是兴奋性神经传导通路激活后，，神经末梢主要释放乙酰胆碱和P物质两种神经递质，引起食管下括约肌的收缩。而抑制性传导通路激活后，导致肠道神经元主要释放一氧化氮和血管活性肠肽两种神经递质，使食管下括约肌舒张。同时还存在其他类型的神经递质参与食管下括约肌的收缩与舒张过程，但目前看，他们并不发挥主要作用。研究文献发现，例如贲门失弛缓症、胡桃夹食管和弥漫性食管痉挛等食管运动障碍性疾病，以及其它涉及食管排空及返流性疾病中，绝大部分表现有食管下括约肌舒张收缩功能异常。综上所述，我们认为只有对食管下括约肌调节机制展开深入的研究，才能开展对食管运动障碍性疾病有效的诊断与治疗。目前国内外关于人食管下括约肌的研究主要集中在P物质、血管活性肠肽、乙酰胆碱、一氧化氮以及等神经递质，信号传导通路以及受体等方面。内皮素（Endothelin, ET）是一种由21个氨基酸组成的生物活性物质。它主要由内皮细胞合成，具有非常强烈的收缩血管的生物活性。近年来研究发现除了具有强烈缩血管作用，同时内皮素也具有诱导导血管生成、促分化、促细胞丝分裂和类细胞生长因子的性质。研究文献发现人有3种内皮素亚型（ET-1、ET-2、ET-3），这三个异构肽的生物活性有一定差异，ET-1的作用最强，ET-3最弱。内皮素分子通过内皮素受体(ETRs)发挥其生理和病理作用。内皮素受体被发现广泛地表达于动物的胃肠道之中。本研究采用实时定量聚合酶链反应(Quantitative PCR)测定各受体的表达相对定量，然后以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证上述结果，在用蛋白印迹法（Western-blot）分析受体蛋白表达是否与mRNA表达一致。然后以受体激动、拮抗及电场刺激（Electrical field stimulation, EFS）等方法对ETRs在人食管下括约肌中的表达及功能进行研究。探讨了ETRs在人食管下括约肌调节机制中的作用，为进一步研究内皮素及其受体在人食管下括约肌调节机制中的作用奠定基础，从而进一步完善了人食管下括约肌的调节机制，为临床治疗食管运动功能障碍性疾病提供了理论依据。第一部分内皮素受体在人食管下括约肌的表达研究目的：内皮素受体属于G蛋白偶联受体家族，内皮素通过内皮素受体发挥生理和病理学功能。先以实时定量聚合酶链反应(Quantitative PCR)测定各受体亚型在食管下括约肌的套索纤维、钩状纤维以及胃底和食管的环行肌中表达相对定量，然后以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证上述结果，在用蛋白印迹法（Western-blot）分析受体蛋白表达是否与mRNA表达一致，探讨内皮素受体在人食管下括约肌中的表达规律。方法：选取2011年12月至2012年11月在河北医科大学第四医院胸外科，罹患高位食管癌行食管大部切除术的患者32例。其中8名女性，24名男性，年龄平均61岁。手术室采集新鲜的手术食管胃结合部标本，实验室以手术剪、镊子锐性剥去包含食管下段、贲门和胃底的标本上所有的粘膜组织及粘膜下层，制备食管、套索纤维、钩状纤维和胃底环行肌的肌条。实验提取组织内的总RNA，以紫外线分光光度计鉴定其纯度后，再以1％琼脂糖凝胶电泳测定其完整性，之后，再分别应用2种内皮素受体亚型的引物行实时定量PCR，测定这两种受体的mRNA在4种肌条表达的ΔCT值，同时测定相应部位组织内β-actinΔCT值，然后以二者计算受体亚型mRNA表达的相对定量。实时定量PCR后的扩增产物以5Xbuffer染色后电泳，验证产物的分子量。再以最初提取的总RNA，分别应用2种内皮素受体亚型的引物行RT-PCR，验证产物分子量。之后测定扩增产物的光密度值(IOD)，再用Gel Pro软件分析，以内皮素受体亚型的IOD与β-actin的IOD的比值代表各个肌条中mRNA的相对表达量。提取各位点的组织总蛋白，以考马斯亮蓝G-250定量蛋白后，将各蛋白样品调至浓度相同，再以电泳仪电泳分离出与内皮素2个亚型相对应的受体蛋白后再转膜，分别以内皮素受体2个亚型的抗体进行孵育，再以荧光二抗染色，经Odyssey软件分析荧光反应条带的光密度值(IOD)。结果：紫外分光度计显示总RNA A260/A280比值为1.8-2.0；1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性，可见28S处电泳条带的宽度和亮度均是18S处条带的约两倍。实时定量PCR的内参β-actin于130bp处，在各个位点的扩增样品中，内参β-actin的实时定量PCR扩增结果一致。计算后发现2种内皮素受体亚型的mRNA在各肌条中均有明确的表达，再将扩增的产物以5Xbuffer染色后电泳，验证其分子量。于166bp和128bp可见两条清晰的条带，分别是内皮素受体A(ETA)，内皮素受体B(ETB)的mRNA。ETA受体亚型的mRNA表达最高，在钩状纤维、套索纤维、食管平滑肌和胃底平滑肌肌条的表达水平分别为0.01151±0.00055；0.01207±0.00086；0.01185±0.00031；0.01161±0.00055；ETB表达水平比ETA低，依次为0.001691±0.00020；0.001793±0.00030；0.001616±0.00028；0.001571±0.00013；实时定量PCR扩增各个产物的长度与最初设计长度完全一致。同一肌条中，不同的内皮素受体亚型mRNA的表达水平比较有统计学差异(F=72.291; P=0.000)。同一个受体亚型在不同的位点，mRNA的表达并无差异(F=0.398; P=0.5329)。再以RT-PCR方法验证上述结果，电泳后检测发现内参β-actin在各个位点的扩增结果基本一致，且与设计分子量一样，同为362bp。ETA和ETB这2种内皮素受体的电泳条带的分子量与设计大小一样，分别为263bp和200bp。ETA相对表达量在钩状纤维、套索纤维、食管平滑肌和胃底平滑肌肌条的表达水平分别为0.01163±0.00062；0.01219±0.00049；0.01147±0.00049；0.01148±0.00054；ETB表达水平比ETA低，依次为0.001725±0.00019；0.001700±0.00029；0.001632±0.00027；0.001625±0.00020；同一肌条中，不同的内皮素受体亚型mRNA的表达水平比较有统计学差异(F=102.827;P=0.000)。同一个受体亚型在不同的位点， mRNA的表达并无差异(F=0.521; P=0.476)。在测定蛋白的表达实验中发现2种内皮素受体的亚型的蛋白在四种肌条内均可见表达，ETA和ETB分子量大小分别为48.73kDa和50kDa。ETA受体亚型的受体蛋白表达最高，在钩状纤维、套索纤维、食管平滑肌和胃底平滑肌肌条的表达水平分别为0.01121±0.00063；0.01145±0.00048；0.01035±0.00068；0.01024±0.00099；ETB表达水平比ETA低，依次为0.001366±0.00022；0.001597±0.00027；0.001289±0.00020；0.001409±0.00021；同一肌条不同的内皮素受体亚型的蛋白表达水平的比较有统计学差异(F=533.841; P=0.000)，其蛋白表达水平的强弱与mRNA表达水平的结果一致。同一内皮素受体亚型的蛋白表达水平在不同的肌条间比较没有统计学差异(F=0.398; P=0.755)。结论：人LES存在两种内皮素受体亚型，分别是ETA、ETB。ETA其表达水平高于ETB，可能在人LES的舒张、收缩功能调节中发挥着作用。第二部分内皮素受体在人食管下括约肌调节机制中的功能目的：研究非选择性内皮素受体激动剂和选择性的内皮素受体拮抗剂对人离体食管下括约肌肌条的套索纤维（sling）、钩状纤维（clasp）的作用，探讨内皮素受体在人食管下括约肌收缩和舒张的过程中所发挥的调节机制。方法：选取2012年10月到2013年12月在河北大学附属医院因高位食管癌行食管大部切除术患者30例。男性患者16例，女性患者14例，平均年龄65岁。手术室采集新鲜标本后剪下食管胃结合部（包含部分食管下端及部分胃底、胃小弯），以手术剪沿胃大弯切开标本全层后，冲洗干净。，将标本粘膜面向上固定于蜡盘中（蜡盘盛Krebs液浸泡过标本表面，并以95％O2和5％CO2的混合气体持续通气）。锐性剥除掉食管下段以及胃贲门部的粘膜层及粘膜下层，可见食管胃结合部的一束增厚、发白的环形肌肉即为食管下括约肌。肉眼识别出位于标本、胃小弯侧的半环形的钩状纤维（clasp）与位于标本两端、斜行走形、胃大弯侧的套索纤维（sling）。分别沿钩状纤维（clasp）和套索纤维（sling）各自肌纤维走行的方向锐性游离肌束，制备用于实验的(2~4) mm×(8~12) mm肌条。将已经用丝线分别扎紧两端的肌条置于37℃恒温、含Krebs液10ml的浴槽中，持续以5%CO2和95%O2的混合气体通气。肌条上端固定于JZ101型肌肉张力换能器，下端固定，肌肉张力大小经Medlab信号采集系统采集后记录肌条的张力变化情况。轻柔、慢速地牵拉肌条，使之张力固定于400mg的稳定状态，将这时肌条保持的长度记录为初始长度L0，接下来多次轻柔、慢速牵拉肌条，每次使其初始长度L0的增加幅度约25％左右，每次肌条在被动张力下稳定15min后才可以再次牵拉。如此反复牵拉（间隔约20min），直至肌条长度被牵拉至初始长度L0的200％，记录肌条长度做为最适初长度。肌条以最适初长度稳定约40分钟后，首先向浴槽中加入10-6mol/L的卡巴胆碱(Carbachol)，待其产生的收缩力达到稳定后采集张力变化数据，洗脱。待肌条恢复原状态后，向浴槽的Krebs液中以浓度累积方式分别加入非选择性内皮素受体激动剂（Endothelin-1, ET-1）。给药浓度为(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)。观察给药后肌条张力变化情况，待肌条的肌力稳定后才可以继续增加一个浓度，每次加药与上一次加药后浓度稳定的时间间隔为5分钟，测定数值后根据数据绘制累计给药的浓度-反应量效曲线。在观察加入拮抗剂后的效应阶段，均于应用激动剂前30min首先加入拮抗剂，拮抗剂的浓度与激动剂诱导肌条产生最大效应的激动剂浓度相同。药物诱发的肌条舒缩反应，均以肌条舒缩产生的张力变化所占卡巴胆碱(Carbachol)于10-6mol/L产生的收缩张力的百分比均数±标准误(x±SE)来表示。结果： 1非选择性内皮素受体激动剂ET-1在10-9mol/L的浓度就可以产生可以检测到的人食管下括约肌钩状纤维（clasp）和套索纤维（sling）肌条的收缩效应。在10-7mol/L时达到最大收缩张力，约为卡巴胆碱于10-6mol/L产生的收缩张力的58%。ET-1在钩状纤维（clasp）和套索纤维（sling）产生的效应无显著性区别(F=0.25P=0.62)。 2应用受体阻滞剂后能拮抗激动剂的的收缩效应。(F=67.9P=0.000)应用选择性的ETA阻滞剂BQ-123在（10-9、10-8、10-7、10-6mol/L）浓度下可以部分拮抗ET-1产生的肌肉收缩作用(F=31.3P=0.0000)。选择性的ETB阻滞剂BQ-788也可部分拮抗ET-1产生的肌肉收缩作用(F=5.6P=0.02511)，其拮抗作用与BQ-123相比较明显较小(F=11.5P=0.0021)。结论： 1非选择性内皮素受体激动剂ET-1在10-9mol/L的浓度可以诱导人食管下括约肌肌条产生收缩效应。随着其浓度的升高逐渐达到最大收缩效应应。提示内皮素受体A(ETA)、内皮素受体B(ETB)可能参与了对人食管下括约肌收缩作用的调节。 2选择性的ETA阻滞剂BQ-123和选择性的ETB阻滞剂BQ-788均可以部分阻断非选择性内皮素受体激动剂ET-1对离体食管下括约肌肌条的收缩作用。进一步说明内皮素受体A(ETA)、内皮素受体B(ETB)不仅参与了对人食管下括约肌的调节，而且ETA和ETB激动后在人食管下括约肌均表现为收缩效应。另外ETA参与收缩效应的比重要大于ETB。第三部分内皮素受体在电刺激诱导人食管下括约肌反应中的作用目的：研究选择性内皮素受体的拮抗剂在电场刺激(EFS)下对人食管下括约肌的套索纤维、钩状纤维的作用，探讨内皮素受体在人食管下括约肌收缩调节机制中发挥的作用。方法：选取2012年10至2013年12月在河北大学附属医院胸外科因高位食管中段癌，而手术食管大部切除术患者30例，其中男性患者21例，女性患者9例，平均年龄61岁。制备套索纤维和钩状纤维肌条，方法同前。将肌条置于保持37℃恒温条件，含10ml Krebs液的浴槽中。并向溶液中以95%O2和5%CO2的混合气体持续通气。将肌条的上端与肌肉张力换能器固定，以带铂金电极的L形的固定架上固定肌条的下端。适当调整肌条位置，使之位于两个平行的环形铂金电极中间，肌条的上下端与电极环间的距离应当在3mm以上，将铂金电极连接于生理药理多用仪行电场刺激(EFS)。肌条张力变化情况利用Medlab信号采集系统记录。将肌肉牵拉至最适初长度方法同前（不同处为：使肌条张力固定于200mg的稳定状态，记录初始长度L0）。肌条以最适初长度稳定约60分钟后，开始行EFS。 EFS刺激参数：单脉冲方波、波宽5ms、电压50V、频率1～512Hz以倍数递增。加入L-NNA后频率从小到大行EFS，计算刺激后的最大效应(Emax)。刺激停止后待肌条恢复平衡，先向浴槽分别加入河豚毒素，在加药20分钟后在给予EFS,比较加药前后刺激人LES出现的反应有何变化。再分别加入选择性内皮素受体A拮抗剂BQ-123（10-6mol/L）；选择性的内皮素受体B拮抗剂BQ-788（10-6mol/L）。在加药后20min后再分别行EFS，比较加药前后EFS刺激人食管下括约肌诱发的肌条反应有无变化。EFS诱发的肌条反应以肌条收缩或舒张的百分比的均数±标准误(x±SE)来表示。结果： 1EFS对人食管下括约肌（钩状纤维和套索纤维）的作用：电场刺激可诱导钩状纤维和套索纤维出现频率依赖性收缩，最大舒张时电刺激频率为128Hz，EFS诱导食管下括约肌收缩的收缩的最大收缩百分比为19.3±0.8％。 2人LES应用河豚毒素后EFS诱导的频率依赖性收缩能明显降低，比较应用前后，肌条的收缩效应有统计学差异（F=23.3P=0.000）。 3人LES因EFS诱导产生的频率依赖性收缩反应，在应用选择性内皮素受体A拮抗剂BQ123（F=0.78P=0.384661）和选择性的内皮素受体B拮抗剂BQ788（F=0.38P=0.542583）前后收缩幅度均无明显减低，差异无显著性。结论： 1应用河豚毒素后能显著降低EFS引起的人LES频率依赖性收缩。比较用药前后肌条的收缩效应发现有统计学差异。提示EFS诱导产生的人LES频率依赖性收缩是神经来源的。 2选择性ETA拮抗剂BQ123和选择性ETB拮抗剂BQ788对EFS引起的人LES的收缩反应均没有抑制作用，用药前后收缩反应的变化均没有统计学差异。提示EFS诱导产生的人食管下括约肌频率依赖性收缩没有ETA和ETB的参与，即内皮素受体A和B亚型并不参与人LES的神经调节。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R571

【参考文献】