IL-18对胰腺星状细胞CX3CL1表达的影响及在慢性胰腺炎中的作用

发布时间：2018-07-13 08:59

【摘要】：慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是以胰腺组织不可逆纤维化损伤为特征的进展性炎性疾病,损伤导致胰腺内、外分泌功能受损,进而出现糖尿病、脂肪泻等临床病症[1,2]。CP有多种病因,饮酒被广泛认为是急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)和CP的主要病因[1,2]。胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSCs)存在于正常的胰腺组织中且一般处于静息状态,在其胞质内储存含维生素A丰富的脂滴;但是,当胰腺受到炎症或者外伤时,静息状态的PSCs转变为具有成肌纤维细胞样表型特征的活化状态,且α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)表达增加[3]。因此,激活的PSCs可能通过分泌一些细胞因子或趋化因子(如转化生长因子β15),以及产生细胞外基质成份(extracellular matrix components,ECM),如I型胶原和纤连蛋白等,在CP发病机制中发挥中心作用[4,5]。目前关于PSCs和CP纤维化之间关系的研究有很多,但关于IL-18、趋化因子CX3CL1与PSCs之间关系以及在CP中作用机制研究相对较少,本实验主要研究CP大鼠和正常大鼠PSCs活化情况和CX3CL1表达情况;以及利用不同浓度IL-18孵育PSCs,了解IL-18对PSCs的作用;并进一步探索IL-18激活PSCs的相关信号通路,探索其发生的机制。第一部分慢性胰腺炎大鼠胰腺星状细胞IL-18、CX3CL1、α-SMA表达情况研究目的:探索慢性胰腺炎大鼠胰腺发生纤维化后胰腺星状细胞激活情况,以及IL-18、趋化因子CX3CL1、α-SMA表达情况。研究方法:正常Wistar雄性大鼠(体重180-200g),通过尾静脉注射DBTC(8mg/Kg)方法造成慢性胰腺炎模型,胰腺组织通过HE染色判断胰腺纤维化发生情况。通过消化法-梯度离心的方法提取出原代胰腺星状细胞,细胞培养4天后,收集细胞,再提取细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测IL-18、CX3CL1、α-SMA m RNA表达情况。结果:RT-PCR法检测对照组PSCs IL-18 m RNA表达量为1.01±0.08,造模组PSCs IL-18 m RNA相对表达量为1.73±0.40,造模组PSCs IL-18 m RNA表达量高于对照组,造模组和对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。对照组PSCs CX3CL1表达量为1.07±0.26,造模组PSCs CX3CL1 m RNA相对表达量为2.22±0.13,造模组PSCs CX3CL1 m RNA表达量高于对照组,造模组和对照组PSCs CX3CL1 m RNA表达差异有统计学意义(t=3.96,P0.05)。对照组PSCsα-SMA m RNA表达量为1.00±0.05,造模组PSCsα-SMA m RNA相对表达量为9.76±0.28,造模组PSCsα-SMA m RNA表达量高于对照组,造模组和对照组PSCsα-SMA m RNA表达差异有统计学意义(t=30.78,P0.01)。结论:胰腺发生纤维化后胰腺星状细胞发生激活,主要变现为α-SMA表达上调;且胰腺发生纤维化后趋化因子CX3CL1的表达上调。第二部分IL-18对胰腺星状细胞活化状态及趋化因子CX3CL1表达的影响研究目的:探讨不同浓度梯度IL-18对胰腺星状细胞活化状态的影响,以及对趋化因子CX3CL1表达的影响。研究方法:人胰腺星状细胞株在星状细胞培养基中培养,传代,取对数生长期细胞接种于六孔板,每孔5x105个细胞,培养后待细胞融合度达到80%后向各孔中分别加入不同浓度梯度的IL-18(5、25、50、100ng/ml),观察72小时后收集细胞,以未处理组为对照组,利用RT-PCR和Western Blot检测E-cadherin、α-SMA、CX3CL1m RNA和蛋白表达情况,观察IL-18是否能激活人PSCs;以及观察IL-18能否上调PSCs中趋化因子CX3CL1表达。结果:对照组、5、25、50、100ng/ml IL-18处理组PSCs的E-cadherin m RNA表达量分别为1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06;α-SMA m RNA表达量分别为1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09;CX3CL1 m RNA表达量分别为1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13。相对于对照组,处理组E-cadherin m RNA的表达下调,α-SMA及CX3CL1 m RNA表达上调,其中100ng/ml处理组与对照组的差异有统计学意义(P值均0.05)。对照组、5、25、50、100ng/ml IL-18处理组PSCs的E-cadherin蛋白表达量分别为1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06;α-SMA蛋白表达量分别为1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02;CX3CL1蛋白表达量分别为1.00±0.05、1.03±0.05、1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12。处理组E-cadherin蛋白表达下调,但各组间的差异无统计学意义;α-SMA蛋白表达上调,IL-18 25ng/ml处理组和对照组间差异有统计学意义(P0.01);IL-18 50ng/ml处理组和对照组间差异有统计学意义(P0.01);IL-18 100ng/ml处理组和对照组间差异有统计学意义(P值0.01);CX3CL1蛋白表达上调,其中IL-18 100ng/ml处理组与对照组的差异有统计学意义(P值0.05)。结论:IL-18能激活人胰腺星状细胞,表现为α-SMA m RNA和蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达下调;且IL-18能上调趋化因子CX3CL1的表达。第三部分PDTC能否缓解IL-18引起的胰腺星状细胞激活及CX3CL1表达上调研究目的:验证NF-κB途径抑制剂PDTC能否缓解IL-18引起的胰腺星状细胞激活及趋化因子CX3CL1表达上调。研究方法:人胰腺星状细胞株在星状细胞培养基中培养,传代。取对数生长期细胞接种于六孔板,每孔5X105个细胞,待各孔细胞融合度达到80%以后加药。实验分为4各组,PDTC处理组(10μmol/L、30μmol/L)、IL-18处理组、正常对照组。利用RT-PCR和蛋白质印迹检测法检测E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 m RNA及蛋白表达水平。结果:对照组、IL-18处理组、PDTC(10μmol/L)+IL-18处理组、PDTC(30μmol/L)+IL-18处理组E-cadherin m RNA表达量为1.01±0.08,0.47±0.03,0.51±0.11,0.90±0.10,各组间差异有统计学意义(F=10.64,P0.01);各组α-SMA m RNA表达量分别为1.02±0.16,4.22±0.57,4.05±0.44,1.82±0.17,组间差异有统计学意义(F=17.88,P0.01);各组CX3CL1 m RNA表达量分别为1.01±0.12,2.38±0.19,2.51±0.19,1.37±0.13,组间差异有统计学意义(F=21.62,P0.01)。PDTC(10μmol/L、30μmol/L)+IL-18处理组与IL-18处理组相比,E-cadherin m RNA表达上调,α-SMA、CX3CL1 m RNA表达下调,差异均没有统计学意义。对照组、IL-18处理组、PDTC(10μmol/L)+IL-18处理组、PDTC(30μmol/L)+IL-18处理组E-cadherin蛋白表达量为1.03±0.08,0.40±0.02,0.49±0.09,1.09±0.04,组间差异有统计学意义(F=33.04,P0.01);各组α-SMA蛋白表达量分别为1.07±0.08,1.87±0.21,1.92±0.21,1.34±0.08,组间差异有统计学意义(F=6.82,P0.05);各组CX3CL1蛋白表达量分别为1.02±0.04,1.38±0.14,1.61±0.08,1.28±0.04,组间差异有统计学意义(F=8.01,P0.01)。PDTC(30μmol/L)+IL-18处理组与IL-18处理组相比,E-cadherin蛋白表达上调且表达差异有统计学意义(P0.01),α-SMA和CX3CL1蛋白表达下调且表达差异没有统计学意义(P0.05)。结论:PDTC不能缓解IL-18引起的胰腺星状细胞激活,且不能下调趋化因子CX3CL1表达。
[Abstract]:鎱㈡，

本文编号：2118846