高表达IFN-γ的MSC构建及其对小鼠肠炎的疗效分析

发布时间：2018-07-13 14:57

【摘要】：间充质干细胞(MSC)是多向分化潜能的非造血祖细胞,可以分化成多种组织细胞。除了分化功能外,MSC可以抑制T细胞和B细胞的激活和增殖并且可以影响DC细胞的成熟。脐带来源的MSC由于其原始性、高扩增率、高分化能力、易获取、无伦理争论和菌污染机会小等优势,所以更具基于细胞治疗发展潜力。已报道,MSC在体外和体内都具有免疫抑制功能,可治疗多种疾病尤其是有关免疫反应的组织损伤。有趣的是,许多研究发现,IFN-γ影响MSC的功能,如增加IDO的表达及增强MSC对T细胞增殖的抑制作用、增加趋化因子受体,细胞间和血管粘附分子的表达、增加IDO的表达量进而影响MSC的分化和单核细胞向M2型巨噬细胞的转化、减弱MSC对NK细胞的敏感性和在异体移植中受体对移植物的拮抗,但是高表达IFN-γ对MSC的免疫调节功能的影响还没有被阐述。我们假设,利用IFN-γ基因修饰MSC,使其成为高表达IFN-γ的MSC,可能有望改善MSC的免疫抑制功能。因此,本研究进行了高表达IFN-γ的MSC (IFN-γ-MSC)构建,并分析了IFN-γ-MSC对DSS诱导的小鼠肠炎模型中的免疫细胞作用及疗效。我们首先成功构建了pcDNA3.1-IFNγ质粒,然后转染进第5代MSC来进行基因修饰,检测了转染质粒后的MSC的表面抗原。结果表明,pcDNA3.1-IFNγ质粒转染的MSC (IFN-y-MSC)不仅高表达IFN-y,而且高表达CD44、CD90、 CD105 (SH2)和CD73 (SH3)等抗原,低表达CD45、CD14、CD34和CD31等造血干细胞表型抗原,这些结果提示,高表达IFN-γ的MSC构建成功。我们还分析了转染pcDNA3.1-IFNγ对MSC的活力、凋亡、周期及增殖的影响,结果显示,转染质粒pcDNA3.1-IFNγ没有明显影响MSC的基本性状。进一步我们分析了转染pcDNA3.1-IFNγ的MSC对T细胞的免疫抑制功能的影响,我们利用淋巴细胞分离液从正常健康人的外周血中获得PBMC后与MSC共同培养,MSC和PBMC以1：10和1：60的比例共同铺于96孔板中,200ul/孔,3天后用3H参入法检测T细胞的增殖情况,将PHA (2.5g/ml)刺激的PBMC作为实验组,没有经过刺激的PBMC作为阴性对照组。结果显示当MSC/PBMC为1：10时,高表达IFN-γ的MSC对T细胞具有明显的抑制作用。其次,我们分析了高表达IFN-γ的MSC对DSS诱导的小鼠肠炎模型中的免疫细胞作用及疗效。根据已有报道,在C57BL/6小鼠的饮用水中融入DSS(3% W/V)连续7天给药即可诱导肠炎模型。DSS诱导的肠炎模型在形态和生化方面有明显特征如DSS模型组小鼠结肠缩短、小鼠体重减轻、腹泻、便血、精神不振等明显症状；在组织学中结肠隐窝损坏、粘膜层损坏、溃疡、炎性细胞侵润等症状。对于DSS诱导的小鼠肠炎模型,当第二天尾静脉注射经过不同处理的MSC进行治疗时,发现转染pcDNA3.1-IFNγ的MSC可明显缓解在实验过程中的小鼠体重减轻、明显增加结肠的长度、降低炎症活性指标(DAI)以及改善小肠的组织结构。还发现,转染pcDNA3.1-IFNγ的MSC可提高模型小鼠肠系膜淋巴结和脾脏中的Treg细胞比例和脾脏中Th2细胞数量,明显抑制结肠组织的炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。这些结果提示,IFN-γ基因修饰的MSC具有较强的免疫抑制功能。综上所述,本研究成功构建了高表达IFN-γ的MSC；发现高表达IFN-γ的MSC (IFN-γ-MSC)可明显抑制T细胞增殖及具有较强地改善DSS诱导的小鼠肠炎模型症状的功能。本研究将为进一步利用基因修饰MSC且使其更加适用于相关疾病的治疗提供了理论依据。
[Abstract]:In addition to the differentiation function , the MSCs can inhibit the activation and proliferation of T cells and B cells and can influence the maturation of DC cells . The results showed that when MSC / PBMC was 1 : 10 , the effect of IFN - 纬 - stimulated PBMC on T - cells was inhibited . The results showed that when MSC / PBMC was 1 : 10 , the high - expression of IFN - 纬 could induce enteritis model . The DSS - induced enteritis model had obvious characteristics in morphology and biochemistry such as shortened colon of mouse in DSS model group , weight loss in mice , diarrhea , hematochezia , and mental invibration .
It was found that MSCs transfected with pcDNA3.1 - IFN纬 could obviously alleviate the weight loss of mouse body weight , increase the length of colon , decrease the inflammatory activity index ( DAI ) and improve the structure of small intestine .
It was found that MSC ( IFN - 纬 - MSC ) with high expression of IFN - 纬 could significantly inhibit the proliferation of T cells and the ability to improve the symptoms of DSS - induced colitis model . This study provides a theoretical basis for further utilization of genetically modified MSC and making it more suitable for treatment of related diseases .
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574

【参考文献】