【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染为世界性健康问题,据WHO报道,全球HCV感染流行率约3%(约1.85亿感染者),每年约3.5万例新发丙型肝炎病例,约50万例患者死于HCV相关疾病。近年来,据国家疾病防治控制中心统计数据,我国上报HCV感染人数逐年上升,2013年的病例数超过22万人。肝硬化及肝细胞癌(hepatocellular cancer,HCC)是慢性丙型肝炎患者致死的主要原因,由此造成的疾病负担成倍增长。肝纤维化是慢性HCV感染进展为肝硬化及终末期肝病的重要病程阶段,Butt等最新研究提出HCV感染早期即出现肝纤维化,且经FIB-4(fibrosis index based on the 4 factor)指数监测11年证实,随着感染时间的延长,肝纤维化呈进行性加重趋势,因此,早期诊断及有效抗肝纤维化治疗是防止该病进展、改善患者生活质量及生存率的主要策略。目前,尚乏准确判断病情及其进展的特异性标志及有效治疗手段,因此,深入研究HCV相关肝纤维化发病机制、主要靶基因,提出新型基因诊断标志及治疗新靶点,对该病的及时诊断及有效防治至关重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的不具备编码蛋白功能的RNA分子,可在表观遗传学调控、转录调控、转录后调控等多个层面调控蛋白编码基因的表达。近年研究表明,lncRNAs差异表达或功能失调参与多种疾病的发生及进展,其与肝细胞再生、炎症反应、免疫反应以及肝癌的发生等密切相关;此外,lncRNAs还可以参与调节肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)功能,影响肝纤维化的发病与进展。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β激活的lncRNA(lncRNA-activated by TGFβ,lncRNA-ATB)被证实参与多种恶性肿瘤的发生、进展及转移,并与肝硬化呈正相关,但是lncRNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的作用及分子机制尚不清楚。本研究采用临床HCV感染病例及建立HCV相关肝纤维化体外细胞模型,旨在明确lncRNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的表达情况,预测其靶标基因及相关信号转导通路,探明其调控靶标基因的机制,以阐明lncRNAs在hcv相关肝纤维化发病中的作用及主要作用机制,为临床从基因水平诊断及防治该病提供新的途径及科学依据。第一部分长链非编码rna-atb在hcv相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化目的:明确lncrna-atb在hcv相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化,分析血浆lncrna-atb作为生物学标记对hcv相关肝纤维化的诊断价值。方法:采用随机对照研究,选择2014年9月至2015年6月在河北医科大学第三医院门诊及住院的慢性hcv感染者36例,并选择15例健康体检者作为健康对照。留取外周静脉血,分别分离血浆、血清,储存于-80℃冰箱备用。hcv感染患者均进行肝穿刺活检术及肝组织病理检查,根据metavir评分系统将hcv患者分为轻度纤维化组(f2;n=14)和中至重度纤维化组(2≤f4;n=22)。另选5例肝移植供体作为健康对照组。血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平采用酶法检测;肝组织切片行苏木素-伊红(haematoxylinandeosin,he)染色及masson三色染色,观察肝组织脂肪变性、炎症及纤维化程度;免疫组织化学染色方法评估肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、?型胶原α1(alpha-1typeicollagen,col1a1)表达;原位杂交方法检测肝组织lncrna-atb表达;采用trizolls提取血浆总rna,以实时荧光定量pcr方法检测血浆lncrna-atb表达。结果:1患者一般情况:健康对照组(n=15),其中男性8例(53.3%),女性7例(46.7%),平均年龄(51.2±11.4)岁;hcv感染患者f2组(n=14),其中男性6例(42.9%),女性8例(57.1%),平均年龄(48.8±11.6)岁;hcv感染患者2≤f4组(n=22),其中男性12例(54.5%),女性10例(45.5%),平均年龄(52.5±7.2)岁。三组年龄之间差异无统计学意义(f=0.596,p=0.555)。2血清alt、ast水平:健康对照组、hcv感染患者f2组及hcv感染患者2≤f4组血清alt中位数分别为17.0、33.0、50.0u/l,三组之间差异具有统计学意义(χ2=23.79,p=0.000);血清ast中位数分别为15.0、32.0、43.5u/l,三组之间差异具有统计学意义(χ2=23.33,p=0.000)。两两比较结果显示,hcv感染患者血清alt、ast均显著高于健康对照组(p值均为0.000);hcv感染患者两组间alt水平无显著性差异(p=0.107),hcv感染患者2≤f4组血清ast显著高于f2组(p=0.000)。3肝组织病理学特征:健康对照组肝小叶结构正常;hcv感染患者f2组肝组织可见肝细胞轻度水样变、部分肝细胞脂肪变性,小叶内可见少许点状肝细胞坏死,肝窦内可见成串淋巴细胞浸润,窦周轻度纤维化;汇管区轻度扩大,可见淋巴滤泡,少量纤维化组织增生;hcv感染患者2≤f4组肝组织可见肝细胞中至重度水样变、部分肝细胞脂肪变性,小叶内散在点状肝细胞坏死,肝窦内可见成串淋巴细胞浸润,可见窦周纤维化;汇管区扩大,可见淋巴滤泡,纤维组织增生明显,形成纤维间隔。4肝组织α-sma、col1a1及lncrna-atb表达:α-sma主要表达于血管壁及肝窦内活化的hsc细胞浆;col1a1主要表达于纤维化间隔;lncrna-atb表达于肝细胞胞浆。与健康对照组相比,肝组织α-sma、col1a1及lncrna-atb表达随着纤维化程度加重而增加。5血浆lncrna-atb表达变化及与肝纤维化分期相关性分析:hcv感染患者血浆lncrna-atb表达水平显著高于健康对照组(z=-5.562,p=0.000),且与肝脏纤维化程度呈正相关(r=0.785,p=0.000);其中,hcv感染患者2≤f4组血浆lncrna-atb显著高于f2组(z=-3.960,p=0.011)。6血浆lncrna-atb诊断肝纤维化的效果分析:应用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,roc)分析显示血浆lncrna-atb水平可用于区分hcv感染患者纤维化程度,曲线下面积为0.877(p=0.000),其诊断特异性为0.880,敏感性为0.787。结论:1.肝组织病理学显示hcv感染患者肝脏炎症及纤维化增加,伴随lncrna-atb表达上调。2.血浆lncrna-atb表达在hcv感染患者中显著升高,并在中至重度肝纤维化患者中进一步升高。并且血浆lncrna-atb水平与hcv相关肝纤维化分期呈正相关。3.血浆lncrna-atb对hcv相关肝纤维化程度具有重要的诊断价值,有望成为诊断hcv相关肝纤维化的新型生物学标记。第二部分长链非编码rna-atb在体外活化的肝星状细胞中的表达变化目的:建立稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系,探明lncrna-atb在hsc活化中的作用。方法:转染pcdna3.1-hcv核心蛋白质粒至hepg2细胞,筛选稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系并进行验证;进一步应用小干扰rna(smallinterferencerna,sirna)转染hepg2-core细胞以敲除转化生长因子(transforminggrowthfactor,tgfβ)1。实时荧光定量pcr和westernblot方法检测hcvcore表达;酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)检测细胞培养上清液中tgfβ1水平。将细胞培养上清作为条件培养基处理人肝星状细胞系lx-2,同时应用重组人tgfβ1按剂量梯度及时间梯度处理lx-2细胞。实时荧光定量pcr、westernblot及免疫细胞荧光染色方法检测α-sma、col1a1表达;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cellcountingkit-8,cck-8)检测细胞增殖情况;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb表达变化。结果:1稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系建立成功:hepg2-core细胞与对照hepg2-nc细胞相比,能够稳定表达hcvcoremrna和蛋白;培养上清液中tgfβ1水平显著升高。si-tgfβ1-1能明显减少hepg2-core细胞tgfβ1mrna表达,并降低细胞培养上清中tgfβ1水平。2hepg2-core细胞培养上清作为条件培养基促进hsc活化:hepg2-core细胞培养上清液促进lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显著增加,与之相比,si-tgfβ1-1转染后的hepg2-core细胞培养上清液引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达程度下降。3重组人tgfβ1促进hsc活化及增殖:重组人tgfβ1显著增加lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达,且呈剂量及时间依赖性。同时选择10ng/ml重组人tgfβ1作用48h促进lx-2细胞α-sma、col1a1蛋白表达增加及细胞增殖。4lncrna-atb在活化的hsc表达显著增加:lncrna-atb表达在hepg2-core细胞培养上清液诱导活化的hsc中显著上调;lncrna-atb表达在重组人tgfβ1诱导活化的hsc中呈剂量及时间依赖性上调。结论:1.稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞上清液可作为条件培养基促进lx-2细胞活化;2.敲除hepg2-core细胞中tgfβ1表达,减少细胞培养上清液中tgfβ1水平,并减少lx-2细胞活化;3.重组人tgfβ1以剂量及时间依赖方式促进细胞活化及增殖;4.lncrna-atb可能为hsc活化的重要分子标志。第三部分长链非编码rna-atb的竞争性内源rna分子调控机制预测及验证目的:预测并验证lncrna-atb作为竞争性内源rna调控相关mirna靶基因的分子机制。方法:采用分子生物信息学分析预测lncrna-atb相关mirna及其靶基因,构建lncrna-atb及靶基因3’-非翻译区(untranslatedregions,utr)野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,与mirna模拟物(mimics)共转染,定量检测双荧光素酶催化产生的荧光数值,验证mirna的作用靶点。应用mirnamimics、抑制剂(inhibitor)以及相应对照转染lx-2细胞,48h后收集细胞,采用实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mirna及α-sma、col1a1mrna表达变化;westernblot方法检测α-sma、col1a1蛋白表达变化。结果:1分子生物信息学预测lncrna-atb相关的mirna及其靶基因:lncrna-atb与ii型tgf-β受体(tgf-βtypeiireceptor,tgf-βrii)和smad2具有相同的mirna-425-5p结合位点(cacagua)。2双荧光素酶报告基因验证mirna-425-5p与lncrna-atb及靶基因结合:结果显示mirna-425-5pmimics可显著下调psi-atb-wt、psi-tgf-βrii-wt、psi-smad2-wt依赖的荧光素酶活性,而对共转染相关的突变型质粒的荧光素酶活性无影响。3mir-425-5p具有抑制肝星状细胞活化的作用:mir-425-5pmimics引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显著下调。相反地,mir-425-5pinhibitor引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显著升高。4mir-425-5p转录后调控作用:mir-425-5pmimics引起lx-2细胞表达mir-425-5p显著升高,其靶基因tgf-βrii和smad2mrna及lncrna-atb表达无明显变化,而其靶基因tgf-βrii和smad2蛋白表达下降;mir-425-5pinhibitor引起lx-2细胞表达mir-425-5p显著下降,其靶基因tgf-βrii和smad2mrna及lncrna-atb表达无明显变化,而其靶基因tgf-βrii和smad2蛋白表达上调。结论:1生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测证实lncrna-atb与tgf-βrii和smad2具有相同的mir-425-5p结合位点。2靶向调控mir-425-5p表达引起lx-2细胞内源性mir-425-5p表达变化,并能通过转录抑制tgf-βrii、smad2蛋白表达及调节α-sma、col1a1mrna及蛋白表达变化。第四部分靶向调控长链非编码rna-atb对肝星状细胞活化的作用及分子机制目的:明确过表达及敲除lncrna-atb对hsc活化的影响及潜在的分子生物学机制。方法:构建lncrna-atb过表达质粒转染lx-2细胞,通过实时荧光定量pcr、westernblot方法检测α-sma、col1a1、tgf-βrii和smad2表达;lx-2细胞增殖通过cck-8试剂盒检测;免疫荧光细胞化学染色检测tgf-βrii和smad2表达;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mir-425-5p表达变化。合成si-atb并转染lx-2细胞,通过实时荧光定量pcr、westernblot方法检测α-sma、col1a1、tgf-βrii和smad2表达;lx-2细胞增殖通过cck-8试剂盒检测;免疫荧光细胞化学染色检测tgf-βrii和smad2表达;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mir-425-5p表达变化。结果:1 LncRNA-ATB促进LX-2细胞活化:过表达lncRNA-ATB可增加LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达,并促进LX-2细胞增殖。2 LncRNA-ATB通过miR-425-5p调控TGF-βRII和SMAD2表达:过表达lncRNA-ATB可增加TGF-βRII和SMAD2蛋白表达而下调内源性mi R-425-5p表达,miR-425-5p mimics共转染可部分恢复上述变化。3敲除lncRNA-ATB抑制HSC活化:si-ATB-1/si-ATB-2/si-ATB-3分别转染LX-2细胞后,结果显示si-ATB-3具有最高的抑制效率。si-ATB-3可抑制LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达,抑制LX-2细胞增殖。4敲除lncRNA-ATB通过上调miR-425-5p抑制TGF-βRII和SMAD2表达:si-ATB-3可减少LX-2细胞TGF-βRII和SMAD2蛋白表达而上调内源性mi R-425-5p表达,miR-425-5p inhibitor共转染可部分恢复上述变化。结论:1过表达lncRNA-ATB可通过降低内源性miR-425-5p上调TGF-βRII和SMAD2表达,促进肝星状细胞活化及增殖。2敲除lncRNA-ATB可增加miR-425-5p而下调TGF-βRII和SMAD2表达,抑制肝星状细胞活化及增殖。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.63;R575.2
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本文编号：
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