血管紧张素Ⅱ受体1结合蛋白（ATRAP）在大鼠肝星形细胞（HSC-T6）中的表达及其在局部肾素血管紧张素系统中的作用

发布时间：2018-10-12 14:51

【摘要】：研究背景：肝纤维化是一个动态、可逆转的过程,是肝脏对慢性持续性损伤的一种修复反应,亦是多种病因(如病毒性肝炎,酒精性肝炎,遗传代谢性肝炎,自身免疫性肝炎等)导致的慢性肝病或肝脏损伤向肝硬化方向发展的病理过程。肝纤维化发展至肝硬化后便不再逆转,肝硬化后肝功能异常使机体出现全身紊乱,而除进行肝移植手术外暂无较好的治疗方法。因此,在肝纤维化早期,如何逆转肝纤维化进程阻断其发展成为肝硬化,具有相当的临床应用价值。但由于其发生机制及影响因素的复杂性目前仍然未有明确的有效方法。因此,肝纤维化治疗的研究中对于肝纤维化机制的研究已成为该领域的重点及难点。肾素血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)具有广泛的生物学效应,它可作用于全身多个器官。心、肾、肺、胰腺和肝脏都存在局部或器官内的RAS,并且参与了组织器官的纤维化和(或)结构重塑过程。在肝组织细胞中同样存在局部RAS,其中血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是重要的成分之一,AngⅡ由血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)的作用下水解产生,并且通过血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type1receptor, AT1R)发挥作用。在肝脏局部组织中,AngⅡ能发出胞内信号传导,提高胞浆内Ca2+的浓度从而刺激肝星形细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的增殖与活化,促使肝纤维化发生发展。通过对AngⅡ介导的信号通路进行抑制,可以减少组织损害引起的纤维化及增殖。现已证实血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂(angiotensin II type1receptor blockers, ARBs)以及血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)在抑制AngⅡ信号通路,抗纤维化及抗增殖方面有一定作用。另有研究证明,血管紧张素(1-7)[angiotensin (1-7), Ang(1-7)]也有同样的反向调节AngⅡ的作用。Ang(1-7)主要是由AngⅡ在血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme2, ACE2)的作用下水解产生,其通过与Mas受体结合来触发新的信号传导发挥其自身效应,拮抗AngⅡ,此外,Ang(1-7)还可以竞争性地与AngⅡ的受体AT1R结合来拮抗AngⅡ的活性,具有舒张血管,降低血压,利尿,抑制成纤维细胞增殖等作用。由此学者们提出,ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴可能是局部RAS发挥其自身内部调节功能的另一个效应轴,即在局部RAS中存在相互联系相互制约的两个作用轴,即ACE-AngⅡ-AT1受体轴和ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴。近年来,有研究发现,血管紧张素Ⅱ的受体1的结合蛋白(angiotensin II type1receptor associated protein, ATRAP)在高血压心脏病的发病过程中可以拮抗AT1R的作用,即对ACE-AngⅡ-AT1受体轴起反向调节作用。ATRAP通过与AT1R羧基末端特异性结合,介导AT1R的内化、减敏及磷酸化来拮抗AT1R信号通路的传导,从而达到其反向调节ACE-AngⅡ-AT1受体轴的作用。此观点在肾脏及心脏组织或细胞的研究中也得到一些研究证实,然而在肝脏纤维化进程中,肝星形细胞是否同样存在ATRAP的表达及其对AngⅡ/AT1R信号的抑制作用,ATRAP在局部RAS中如何发挥调节作用,目前尚未见研究报道。因此,在本研究中,我们利用大鼠永生化肝星形细胞株(HSC-T6)作为研究对象,利用实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)技术及Western blot技术检测正常状态下生长的HSC-T6细胞中是否存在ATRAP的表达,并通过改变HSC-T6局部RAS的成分,破坏其平衡,即分别加入AngⅡ及Ang(1-7)对细胞株进行刺激,探讨ATRAP与局部肾素血管紧张素系统中ACE-AngⅡ-AT1受体轴、ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴之间可能存在的关系,即ATRAP在局部RAS中的调节作用。实验方法： 1、大鼠肝星形细胞(HSC-T6)的培养及处理前准备：在37℃、体积分数5%的C02条件下,将HSC-T6培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中,每日观察其细胞形态和生长状况,每周传代2次。进行细胞干预实验前,将细胞传代至6孔板中,以约4×105cells/mL的细胞密度,集中1mL细胞,其后补加1mL培养基,轻摇使细胞均匀分散,其后至于C02培养箱中培养。待细胞贴壁后,更换培养基为含有1μmol/L各实验药物的培养基,对照组仍为完全培养基,处理后继续培养箱中培养。 2、用浓度为1μmol/L的药物AngⅡ对HSC-T6进行单次小剂量刺激处理,刺激后继续培养箱中培养,分别在刺激后2小时、6小时、12小时、18小时、24小时以及36小时等6个时间点收集细胞,利用实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)检测HSC-T6在以上各时间点目的基因ATRAP、血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)、Mas受体以及血管紧张素转换酶2(ACE2)等mRNA的表达水平,利用Western blot技术检测上述各时间点,各目的基因的蛋白质表达水平。此为AngⅡ实验组。 3、用浓度为1μmol/L的药物Ang(1-7)对HSC-T6进行单次小剂量刺激处理,刺激后继续培养箱中培养,分别在刺激后2小时、6小时、12小时、18小时、24小时以及36小时等6个时间点收集细胞,利用实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)检测HSC-T6在以上各时间点目的基因ATRAP.血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)、Mas受体以及血管紧张素转换酶2(ACE2)等mRNA的表达水平,利用Western blot技术检测上述各时间点,各目的基因的蛋白质表达水平。此为Ang(1-7)实验组。 4、未作任何药物刺激处理的肝星形细胞作为阴性对照组,在以上相同时间点收集细胞,qRT-PCR及Western blot检测各时间点,各目的基因的mRNA及蛋白质水平。 5、采用单因素方差分析(One-way ANOVA)分析同一处理组中某一目的基因mRNA或蛋白的表达量是否随时间的变化而存在差异,两独立样本T检验的方法用于分析在同一时间点某一目的基因在药物刺激组与对照组表达是否存在差异。实验结果： 1、目的基因在HSC-T6中表达的基线水平在对照组中,mRNA水平及蛋白水平皆可检测到ATRAP, AT1受体,Mas受体及ACE2四个目的基因在HSC-T6中均有表达。ATRAP, AT1受体及Mas受体的表达量相对维持在比较稳定的水平,2小时,6小时,12小时,18小时,24小时及36小时均未见明显改变(P0.05)。然而ACE2的表达量随观察时间的变化有所起伏(F=87.56,P=0.000)。将基线2小时ACE2基因mRNA水平表达量定为1,那么6小时,12小时,18小时,24小时及36小时时间点相对表达量分别为：1.52,1.56,1.93,2.18,1.76。Western blot结果显示与mRNA水平较为一致,各时间点蛋白相对表达量分别为1,1.13,1.06,0.94,2,1.74。 2、单次AngⅡ刺激后目的基因在HSC-T6中表达的改变在单次小剂量的AngⅡ刺激后,对于mRNA结果进行统计,单因素方差分析结果提示,ATRAP及ACE2的表达水平随培养时间变化而有所改变(F=47.49,P=0.000和F=-262.05,P=0.000)。与基线水平相比较,ATRAP自刺激后12小时起,其表达量维持在较高水平(12小时点P=0.003,18,24及36小时点P=0.000)。对于ACE2基因,在刺激后6小时点出现了一个明显的高表达(P=0.01),之后在12小时又回落至基线水平(P=0.831),之后一直维持在略低于基线的表达量(各点均是P=0.000)。处理之后的HSC-T6中AT1受体及Mas受体均无明显改变,与对照组各时间点分别相比较,也未见明显差异(P0.05)。Western blot结果大致与mRNA结果一致,或部分较晚出现与mRNA相同的变化趋势,更验证了mRNA的表达趋势变化。 3、单次Ang(1-7)刺激后目的基因在HSC-T6中表达的改变在单次小剂量Ang(1-7)刺激之后,对于mRNA结果进行统计,单因素方差分析结果提示ATRAP及ACE2的表达量都随时间改变有所不同(F=8.447,P=0.01和F=132.39,P=0.000)。ATRAP自6小时起到观察终点,都有较高的表达量(各点分别为P=0.029,0.000,0.003,0.03,0.002),且在12小时点表达量最高。它的mRNA表达趋势基本同于蛋白表达。而ACE2基因表达受抑制,自6小时起(P=0.008),其表达量与同时刻对照组表达量比较,皆低于基线水平,在18小时达最低(P=0.000)。ACE2蛋白的表达抑制出现于刺激后24小时,较晚于mRNA的变化。同样的,单次小剂量的Ang(1-7)刺激并未引起AT1受体及Mas受体表达改变。结论： 1、在对照处理组(即阴性对照)中HSC-T6有AT1受体、ATRAP、Mas受体以及ACE2的表达。除ACE2随观察时间的变化表达量略有改变,其余目的基因表达量都处于较低的水平且保持相对稳定。肝组织局部存在RAS成分表达已有研究报道,但对于ATRAP基因在肝组织细胞的表达尚未见报道,本研究首次验证了大鼠肝星形细胞(HSC-T6)中存在ATRAP基因的表达。 2、大鼠肝星形细胞(HSC-T6)中RAS的各成分之间是相互联系相互制约的,ACE-AngⅡ-AT1受体轴与ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴之间的平衡关系确切存在。当小剂量AngⅡ刺激HSC-T6后,AngⅡ通过AT1受体介导下游信号传导,促进细胞增殖,与此同时,局部RAS开始启动自身平衡调节作用,此信号通路信号的增强也激活了负性调节因子的作用,ATRAP及ACE2活化上调。对于ATRAP,其可能是通过介导AT1受体内化、脱敏和磷酸化等而发挥作用,而并不抑制AT1受体的表达量。 3、Ang(1-7)刺激HSC-T6直接效应是引起ACE2基因与蛋白的表达量下调,而Mas受体则无明显改变。另外Ang(1-7)浓度的增加可能通过细胞局部RAS自身平衡调节机制引起ACE-AngⅡ-AT1受体轴的上调,而反应性增高AngⅡ从而导致了ATRAP表达水平的上调。 4、ATRAP基因表达的改变可能对AngⅡ的上升比对于Ang(1-7)更为敏感,即ATRAP上调表达来拮抗ACE-AngⅡ-AT1受体轴,从而发挥其在局部RAS中调节平衡的作用。 5、ATRAP在HSC-T6中存在表达,并参与局部RAS的自身调节,有拮抗局部AngⅡ的作用。单次低剂量的AngⅡ或Ang(1-7)的刺激都会引起HSC-T6中ATRAP的表达增多。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575

【参考文献】