内质网应激诱导大鼠肝星状细胞凋亡的机制研究

发布时间：2017-01-02 16:33

  本文关键词：内质网应激诱导大鼠肝星状细胞凋亡的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

《安徽医科大学》 2014年

内质网应激诱导大鼠肝星状细胞凋亡的机制研究

李晓慧  

【摘要】：肝纤维化（liver fibrosis）是多种慢性肝病发展的共同病理基础，其发病机制的中心环节是静止的肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）活化增殖，导致以胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积。因此，促进活化的HSC凋亡是防治肝纤维化的重要手段。 内质网（Endoplasmic reticulum, ER）是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所，同时也是调节细胞内钙水平的场所。内质网应激（Endoplasmic reticulumstress, ERS）所诱导的细胞凋亡是近年来新被认识的一种凋亡途径，与经典线粒体、死亡受体介导的细胞凋亡不同。ERS通过减少未折叠蛋白或错误折叠蛋白的沉积，ERS激活促凋亡信号通路与多种疾病密切相关，但ERS在诱导活化肝星状细胞凋亡的作用及机制尚不清楚。 本实验选用大鼠肝星状细胞系HSC-T6为研究对象，并以PDGF诱导其活化，探讨ERS对HSC凋亡的调控及相关机制，主要研究内容概括如下： 1. ERS促进活化的HSC凋亡 为了观察ERS对活化的HSC凋亡的影响，给予PDGF体外诱导HSC-T6活化作为对照组，再分别给予内质网应激的诱导剂毒胡萝卜素（Thapsigargin, TG）处理，采用流式细胞仪检测ERS对活化的HSC凋亡的影响。结果发现，TG组的细胞凋亡率明显高于对照组，提示ERS可能参与活化HSC的凋亡。 2. ERS对活化HSC分泌α-SMA和Col1α1的影响 为了观察ERS对活化的HSC分泌α-SMA和Col1α1的影响，给予PDGF体外诱导HSC活化作为对照组，再分别给予TG处理，采用Western blot法检测肝纤维化标志性蛋白α-SMA、Col1α1的表达。结果发现，PDGF体外诱导HSC活化，α-SMA与Col1α1蛋白的表达明显上调；与对照组相比，TG组α-SMA、Col1α1的表达显著下调。提示ERS可能抑制活化HSC分泌α-SMA和Col1α1的表达。 3. ERS诱导活化HSC凋亡的调控及部分机制的研究 为了观察Ca2+对ERS诱导活化的HSC凋亡的影响，以TG诱导活化的HSC作为模型组，再分别给予钙离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM处理，流式细胞术检测细胞凋亡率，采用Western blot法检测Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38MAPK蛋白的表达。结果发现，与正常组比较，TG明显促进HSC凋亡，同时发现TG能显著促进HSC中Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38MAPK蛋白的表达及活化，而给予EGTA和BAPTA/AM干预后，HSC的凋亡明显受到抑制，Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38MAPK蛋白表达及活性均受到抑制。提示ERS诱导的活化HSC凋亡机制可能与细胞内钙离子调节Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38MAPK蛋白的表达有关。 为了进一步探讨ERS诱导活化HSC凋亡的机制，，分别给予Calpain抑制剂Calpeptin、Pan-Capase抑制剂z-VAD-FKM、JNK抑制剂SP600125及p38MAPK抑制剂SB202190处理，采用流式细胞术观察HSC凋亡率，Western blot法检测Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38MAPK蛋白的表达。结果发现，与正常组比较，C-Capase-12、Capase-9和C-Capase-3的蛋白表达明显下降，而Pan-Capase抑制剂z-VAD-FKM组Calpain的蛋白表达无明显变化。提示ERS诱导的活化HSC凋亡机制可能与细胞内钙离子调节Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38MAPK蛋白的表达有关。 4.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing-ligand, TRAIL）通过ERS对活化的HSC凋亡的调控及部分机制的研究 前期研究结果发现：在肝纤维化逆转恢复期，枯否细胞可以通过分泌TRAIL诱导活化HSC凋亡。为了进一步探讨TRAIL与ERS诱导的活化HSC凋亡的相互关联。体外给予PDGF刺激活化的HSC，再分别给予TRAIL与ERS诱导剂衣霉素（Tunicamycin, TN）处理，观察各组凋亡基因Bax mRNA、Caspase-3、内质网应激相关蛋白Caspase-12，CHOP，GRP78的表达。结果发现，与PDGF刺激活化的HSC的对照组相比较，TRAIL组与TN组Bax mRNA表达明显上调、Caspase-3的活化增加，内质网应激相关蛋白Caspase-12，CHOP，GRP78的表达均明显上调。提示ERS可能参与TRAIL调控活化的HSC凋亡。 以上结果提示，ERS参与活化HSC凋亡的调控，其机制可能与其释放细胞内钙离子，导致细胞内钙离子升高，从而诱导Calpain/Caspase和JNK/p38MAPK激活有关。TRAIL可能通过诱导PDGF活化的HSC中内质网应激相关蛋白CHOP，GRP78，Caspase-12的表达，从而促进HSC的凋亡。

【关键词】：
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575
【目录】：

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