IL-17对T84细胞通透性及Gal-9表达的影响

发布时间：2018-11-21 18:48

【摘要】：研究背景炎症性肠病（Inflammatory bowel disease, IBD)是一种近年发病率明显增高，但病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD）两种。目前研究发现肠道黏膜屏障受损与该病的发生密切相关。随着对Th17细胞及其分泌的主要效应细胞因子IL-17的研究，IL-17在该病中的作用逐渐受到关注。半乳糖凝集素9(Galectin-9,Gal-9)是半乳糖凝集素家族的一员，存在于各种生物体内，是一种多糖连接蛋白，我们在前期研究发现Gal-9可能与肠上皮细胞之间的紧密连接有关，Gal-9很可能参与维持上皮细胞连接的功能。现在有关IL-17肠上皮黏膜屏障的关系如何，以及Gal-9的表达与黏膜屏障完整性的关系的研究较少。目的采用Transwell细胞跨膜共同培养系统培养T84细胞单层（T84monolayar）,模拟肠上皮屏障，通过测量IL-17处理前后T84细胞单层的跨上皮电阻（Transepithelial electric resistance，TER）、辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）流量的检测，研究IL-17对T84细胞单层通透性的影响。进而研究T84细胞单层通透性变化后相应处理组T84细胞单层Gal-9表达的变化，进一步探讨Gal-9与肠上皮黏膜屏障完整性的关系。方法 1．本实验利用T84细胞单层。研究IL-17对T84对细胞单层通透性的影响，我们将IL-17以及HRP加入到细胞跨膜培养系统肠腔侧中。通过酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immune assay,ELISA)的方法检测基底侧样本中的HRP，并测量T84细胞的TER变化。以T84细胞单层TER及HRP流量作为评价T84细胞单层的通透性指标。 2.不同浓度的IL-17加入细胞培养系统中与T84细胞共同孵育。2小时后测量T84细胞单层TER及HRP流量变化，从而评价不同浓度IL-17对肠上皮细胞系T84细胞单层的屏障功能的影响。 3.细胞跨膜培养系统随机分为正常对照组、IL-17组，并给予相应处理。共同培养2小时后，测量各组的TER以及HRP流量。然后收集正常对照组、IL-17组T84细胞上清液，对测量各组的TER以及HRP流量进行数据分析后，采用ELISA方法检测相应组细胞上清液中Gal-9的变化。从而评价T84细胞单层通透性变化后，肠上皮细胞系T84细胞单层的Gal-9表达的变化。 4.细胞跨膜培养系统随机分为正常对照组、IL-17组给予相应处理。共同培养2小时后，测量各组的TER以及HRP流量。收集正常对照组、IL-17组各培养系统中T84细胞，对测量各组的TER以及HRP流量进行数据分析后，用免疫细胞化学的方法检测T84细胞通透性发生变化相应浓度IL-17组的Gal-9的表达。从而评价T84细胞单层通透性变化后，肠上皮细胞系T84细胞单层的Gal-9表达的变化。 5．将上述所有实验结果采用SPSS17.0统计软件系统进行分析，所有计量数据均采用均数±标准差进行描述，，用Shapiro-Wilk检验方法进行正态性分析，用Levene检验方法进行方差齐性分析，多组数据间的比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），对多组数据比较有统计学意义的再进行两两比较（LSD-t检验）。两组数据的比较采用两独立样本的t检验，相关性分析用Spearman秩相关。检验水准α=0.05，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。结果 1．不同浓度IL-17加入细胞跨膜培养系统肠腔侧后，各浓度的IL-17对T84上皮细胞刺激前后，各浓度IL-17T84上皮细胞相对TER（comparative TER）表现为：当IL-17浓度小于50ng/ml时，增加肠腔侧IL-17浓度，不引起上皮细胞跨膜电阻的下降。但当IL-17浓度大于50ng/ml时，随着IL-17浓度增加，跨膜电阻逐渐下降，与正常对照组及小浓度IL-17组比较，差异有统计学意义（F=560.34，P 0.05）。不同浓度IL-17加入跨膜培养系统肠腔侧，HRP流量变化如下：当IL-17浓度小于50ng/ml时，增加肠腔侧IL-17浓度，不引起HRP流量的增加。但当IL-17浓度大于50ng/ml时，随着IL-17浓度增加，HRP流量逐渐增加，与正常对照组及小浓度IL-17组比较，差异有统计学意义（F=159.22，P 0.05）。 2.光学显微镜下观察免疫细胞化学结果：IL-17干预过的T84细胞（IL-17组）细胞质、细胞核、细胞膜被染成棕褐色，相对于正常生长T84细胞（阴性对照组）细胞质、细胞核、细胞膜被染成棕褐色程度明显降低。结果提示：细胞单层通透性增加后，细胞表达的Gal-9较细胞单层通透性正常的Gal-9降低。用ELISA方法检测肠腔侧细胞上清液中Gal-9的水平结果显示：高浓度IL-17组明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P 0.05）,提示IL-17作用于T84细胞单层引起通透性改变后，相应作用组细胞上清液中Gal-9的表达量较未干预组明显降低。 3．HRP流量与Gal-9的相关性分析结果：Gal-9与HRP流量之间r=-0.942，P 0.01,说明上清液中Gal-9浓度与HRP流量之间呈负相关关系。结论 1．IL-17能造成T84细胞单层通透性的增加。 2．T84细胞单层通透性增加后Gal-9的表达量减少。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R574

【参考文献】